1株犬源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

张 玮 ， 张启龙 ， 王羽新 ， 刘海莹 ， 王 林 ， 傅彩霞 ， 周德刚

(1.北京市动物疫病预防控制中心 ， 北京 大兴 102609 ； 2.中国动物疫病预防控制中心 ， 北京 朝阳 100125)

宠物犬的腹泻为临床中常见的疾病之一，引起腹泻的病原主要有致病性大肠杆菌、沙门菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌等，其中，致病性大肠杆菌是引起宠物犬腹泻最为常见的疾病[1]。宠物犬大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的犬急性肠道传染性疾病，患犬主要症状为腹泻，有败血症表现，可引起泌尿系统感染、睾丸炎、子宫内膜炎等，严重可导致死亡[2]。宠物犬大肠杆菌病主要通过抗生素进行治疗，由于抗生素的不合理使用，宠物犬源大肠杆菌产生了很强的耐药性，宠物犬长期与人接触可能会把携带耐药性的大肠杆菌传播给人类，应引起高度重视[3]。本试验通过对北京市某动物医院1例患顽固性腹泻病例的宠物犬无菌采集肛门拭子，经病原检测、细菌分离与形态学观察、生化鉴定等试验分离出1株大肠杆菌，命名为37-Canine株。对分离出的37-Canine株的致泻型、耐药性及16S rDNA序列进行了分析，旨在为由犬源大肠杆菌引起腹泻病例的治疗用药选择提供指导，避免盲目用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 北京市某动物医院1例就诊顽固性腹泻宠物犬，应用了庆大霉素、阿莫西林等药物均未见好转，犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒等病原胶体金试纸检测均为阴性。无菌采集病犬肛门拭子，装入灭菌PBS离心管中并标记，于4 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、营养肉汤，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司；革兰阴性细菌鉴定卡，购自梅里埃诊断产品(上海)有限公司；5种致泻型大肠杆菌核酸检测试剂盒，购自深圳生科原生物股份有限公司；细菌DNA核酸提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要仪器 QuantStudio7 Flex荧光定量PCR仪，由美国AB公司生产；全自动革兰染色仪、VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统，由法国梅里埃公司生产；TGuide S32全自动核酸提取仪，由天根生化科技(北京)有限公司生产。

1.1.4 引物合成 根据GenBank已公布的大肠杆菌通用16S rDNA基因序列以及氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类耐药基因序列设计合成引物(表1)，用于大肠杆菌分离鉴定及耐药基因分析，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR扩增的耐药基因和毒力基因引物信息

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离与纯化 在无菌条件下，取出临床采集的肛门拭子，接种于麦康凯琼脂平板上，37 ℃恒温培养18 h。用一次性无菌接种环挑取单个菌落，纯化培养，观察并记录菌落形态、颜色等特征；挑取纯化培养的菌落接种于伊红美蓝琼脂平板上，37 ℃恒温培养18 h后，观察菌落形态、颜色等特征；用一次性无菌接种环挑取多个纯化培养的菌落接种于营养肉汤中，置37 ℃摇床振荡培养12 h后，取出进行革兰染色，并在显微镜下观察菌落形态。

1.2.2 细菌的生化鉴定 在无菌条件下，取出纯培养的细菌菌液，按照革兰阴性细菌鉴定卡说明书进行操作，用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行生化试验鉴定。

1.2.3 16S rDNA基因的PCR扩增及测序 采用16S rDNA通用引物，按照购买的细菌DNA核酸提取试剂盒说明书，对纯化好的细菌培养液进行DNA提取，以提取好的基因组DNA为模板。PCR反应体系： DNA模板5 μL，上游引物(10 μM)0.5 μL，下游引物(10 μM)0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，超纯水6.5 μL，总反应体积25 μL。循环条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，共 35 个循环；72 ℃再延伸10 min。取出PCR产物5 μL，在1%琼脂糖凝胶电泳上电泳检查结果，预期扩增片段长约1 500 bp。将扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。根据测序获得的序列结果与GenBank中大肠杆菌参考株的基因进行同源性比较。

1.2.4 大肠杆菌致泻型检测 以提取好的基因组DNA为模板，按照“5种致泻型大肠杆菌核酸检测试剂盒”产品说明书要求配制反应体系，通过QuantStudio7 Flex荧光定量PCR仪进行试验，对试验结果进行分析，判断37-Canine株是否具有致病性。

1.2.5 药敏试验 无菌环境下，取出纯培养的细菌菌液，均匀涂布于营养琼脂表面，待菌液吸收后，选取目前北京市地区动物医院临床常用的8种抗菌药：多黏菌素B 300 IU/片、庆大霉素120 μg/片、阿莫西林10 μg/片、头孢曲松30 μg/片、头孢噻肟30 μg/片、氨苄西林10 μg/片、诺氟沙星10 μg/片、磺胺嘧啶300 μg/片，采用K-B纸片扩散法，37 ℃ 培养24 h；观察抑菌圈大小，用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据抑菌圈大小判断耐药性。

1.2.6 四类耐药基因检测 以提取好的基因组DNA为模板，分别对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类耐药基因进行PCR试验。

PCR反应体系：DNA模板5 μL，上游引物(10 μM)1 μL，下游引物(10 μM)1 μL，2×TaqPCR Master Mix 25μL，超纯水6.5 μL，总体积50 μL。循环条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性35s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。取出PCR产物5μL，在1%琼脂糖凝胶电泳上电泳检查结果。

2 结果

2.1 细菌的分离与纯化 37-Canine株在麦康凯培养基上出现玫瑰红、圆形、光滑、隆起、湿润、边缘不整齐的菌落；伊红美蓝培养基上出现具有金属光泽的圆形、光滑、隆起、边缘规则的菌落。革兰染色结果为阴性，显微镜下观察呈现短杆状结构，两端钝圆，散在存在的阴性杆状菌。

2.2 细菌的生化鉴定 生化试验结果见表2。 37-Canine株不能分解D-麦芽糖，能分解D-葡萄糖、D-甘露醇，吲哚呈阳性，不产生H2S。经VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定为大肠杆菌，评定结果为合格率99.9%。

表2 分离菌株的生化鉴定结果

+: 阳性; -:阴性

2.3 16S rDNA基因的PCR扩增及测序 对37-Canine株大肠杆菌PCR扩增后进行电泳试验，得到了约1 500 bp的目标片段(见图1)。37-Canine株扩增序列与GenBank中大肠杆菌参考株基因序列的同源性达到99%。通过与参考株的16S rDNA基因序列比对后构建进化树(见图2)，发现37-Canine株与AP018488.1参考株被划为一支，说明该两菌株间的同源性较高。

图1 细菌的16S rDNA基因扩增图谱
M: DL-2 000 DNA Marker； 1: 37-Canine株

图2 分离菌16S rDNA基因序列的系统进化树

2.4 大肠杆菌致泻型检测结果 5种致泻型大肠杆菌荧光PCR结果表明，37-Canine株含有的ipaH、lt、stp(stla)、sth(stlb)基因；stx1、stx2基因检测阳性；pic基因检测阳性。综合判定37-Canine株为EIEC-EPEC-EHEC的杂合型大肠杆菌菌株，具有致泻性，属致病性大肠杆菌。

2.5 药敏试验 结果见表3。37-Canine株对头孢曲松钠、头孢噻肟、诺氟沙星3种药物敏感；对多黏菌素B、庆大霉素2种药物中度敏感；对阿莫西林、磺胺嘧啶、氨苄西林3种药物耐药。

表3 分离菌株的药敏试验结果

S：敏感，抑菌环直径>15 mm; I：中度敏感，抑菌圈直径为 10～15 mm; R：耐药，抑菌圈直径为 0～10 mm

2.6 耐药基因检测 耐药基因检测结果(见图3～图6)。PCR试验扩增出与aadA、aacC2、tetA、tetB预期大小一致的条带，37-Canine株不携带氟喹诺酮类耐药基因，携带氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类耐药基因，最终表明37-Canine株对多种抗菌药物耐药。

图3 氟喹诺酮类耐药基因的检测结果
M: DL-100 DNA Marker； 1:qnrA； 2:qnrB； 3:aac(6′)-Ib

3 讨论

大肠杆菌是自然界广泛存在的一种菌株，不同宿主来源或非致病性与致病性菌株间，基因组差异大，由此致病性等生理特性各不相同，参与腹泻疾病的大肠杆菌菌株是腹泻的各种病因中最重要的一种。致病性大肠杆菌为人兽共患病原菌，不同国家的宠物源性大肠杆菌的耐药性差别较大。据报道，澳大利亚的犬源大肠杆菌除氨苄西林和四环素外，大多数分离株对所有测试的抗生素都敏感。丹麦、西班牙和瑞典等国家的犬源大肠杆菌对氨苄西林、磺胺类药物、四环素等药物耐药性较高，对头孢菌素、氟喹诺酮类药物相对较敏感[4]。在本试验中，37-Canine株携带氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类耐药基因，对头孢曲松钠、头孢噻肟、诺氟沙星3种药物敏感；多黏菌素B、庆大霉素2种药物中度敏感；阿莫西林、磺胺嘧啶、氨苄西林3种药物耐药。说明北京市地区犬源大肠杆菌的耐药性也比较严重。因此，在宠物犬临床腹泻病例治疗过程中，需要合理使用抗生素，尤其是在菌株出现中度敏感且又存在相关药物耐药基因趋势时要慎重考虑。

图4 氨基糖苷类耐药基因的检测结果
M:DL-100 DNA Marker；1:ahpA3； 2:aacC4； 3:aadA； 4:aacC2

图5 四环素类耐药基因的检测结果
M:DL-100 DNA Marker； 1:tetA； 2:tetB

图6 氯霉素类耐药基因的检测结果
M:DL-100 DNA Marker； 1:catI； 2:floR； 3:cm1A

目前，伴侣动物耐药菌产生与流行的问题已得到国内外的广泛关注[5]，伴侣动物的抗生素的使用与人类使用抗生素治疗疾病的使用有诸多的相同点。伴侣动物耐药菌的形成与人耐药菌的形成存在共性，耐药基因在宠物犬和人类之间传播的报道也日益增多[6]。大量研究表明，我国动物源性细菌抗生素耐药情况比国外更为严重，抗生素使用和细菌耐药性发生和传播存在直接因果关系[7]。目前北京地区动物医院临床医师存在有病乱用药、联合用药、用药剂量过大、用药没有针对性等原因诱发伴侣动物细菌产生耐药性。本文通过对37-Canine株大肠杆菌耐药性的检测，今后积极开展宠物源性细菌耐药性监测，定期归纳总结耐药趋势，对防治北京市地区宠物源性细菌疾病临床药物使用提供有效的依据。