板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

刘裕峰，朱天辉，刘应高，谯天敏，李姝江，龙旭梅，韩 珊

（四川农业大学林学院，成都 611130）

首次发现动植物组织能够分解过氧化氢产生氧气可追溯到1811年，后被发现可能是某种酶起作用，直到1901年，该酶被命名为过氧化氢酶（hudrogen peroxidase），又名触酶（catalase，CAT）[1]。现已发现在动物、植物及微生物体内均含有大量的CAT。病原菌的入侵会打破超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（·OH）等活性氧类（reactive oxygen species，ROS）物质的动态平衡，导致活性氧物质在植物体内大量积累，长时间的积累而得不到有效的清除，会损伤植物细胞膜系统，破坏蛋白质功能，严重时导致植株死亡[2]。CAT 作为植物体内主要的抗氧化酶之一，它能够催化植物光呼吸、线粒体电子传递及脂肪酸氧化等过程中产生的H2O2生成O2和H2O[3]。有报道称[4]，一分子CAT 每分钟能将大约6×106个H2O2分子转化成H2O 和O2。因此，CAT 对H2O2的清除具有较高的特异性，并且在去除H2O2过量中起关键作用[5]，使得植物不受伤害。

大量研究表明，CAT 与植物的抗病性存在着紧密的联系。Pei Z.M.等[6]研究发现，缺失CAT 基因的烟草体内H2O2含量增加，导致细胞死亡；Jiang M.等[7]发现，植物的CAT 活性能够被水杨酸抗病因子抑制，导致过多的ROS 产生，进而引起植物系统性的防御反应；病原菌浸染植物的初期阶段，CAT 催化H2O2生成O2，触发苯甲酸生成水杨酸，导致系统性防卫反应的发生[8]；转玉米CAT2 基因的烟草遭受病原菌侵染后，诱发严重的超敏反应，进而有效地控制细菌的进一步感染[9]；转基因烟草植株体内酵母CAT1 基因的过量表达，能够提高转基因植株的抗病毒侵染能力[10]。

植物CAT 基因家族由多个基因编码，其表达受病原、温度、光照、干旱等多种因子的调控[11]。目前，已从火龙果[12]、人参[13]、甘薯[14]、南瓜[15]、水稻[16]、坛紫菜[17]等多种植物中克隆获得CAT 基因并进行相关分析。但目前关于板栗CAT 基因的相关研究较少，异源表达方面的研究尚属空白。本研究在板栗转录组学研究[18]的基础上，利用RT-PCR 技术克隆获得板栗CAT 基因全长cDNA 序列，并进行了相关生物信息学分析，同时构建pET28a-CmCAT 原核表达载体，在大肠杆菌中进行了融合表达，旨在了解其基因结构和功能，为进一步研究板栗抗病的分子机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试板栗品种为“石丰”，种植于四川农业大学林学院崇州基地；植物RNA 提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司；PCR 反转录试剂盒、pMD19-T 载体购自大连TaKaRa 公司；DNA 纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；表达载体pET-28a 由四川农业大学林学院林木病理学实验室提供；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶EcoRI、XhoI、T4DNA 连接酶购自NEB（北京）有限公司；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2 总RNA 的提取与cDNA 的合成

以板栗幼叶作为RNA 提取材料，使用植物多糖多酚RNA 提取试剂盒（北京华越洋生物）提取总RNA。提取的总RNA 经BioMate 3S（BioMate 3S，Thermo Scientific）及1%的琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和完整性。cDNA 第一链的合成使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（TaKaRa，大连），具体操作步骤参照说明书进行。合成的cDNA保存于-80 ℃，用于后续试验。

1.3 CmCAT 基因的克隆

根据NCBI 数据库中已公布的其他植物CAT基因核苷酸序列，将其与板栗基因组数据库（http：//www.hardwoodgenomics.org/）进行同源比对，寻找并分析板栗CAT 基因EST 序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计一对特异性引物CmCAT-F：5'-ATG GATCCCTACAAGTACCG-3'，CmCAT-R：5'- TCA CATTGTTGGCCTCAC-3'。以反转录的板栗cDNA为模板，进行PCR 扩增，反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环；72 ℃终延伸7 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行纯化回收，回收片段连接pMD19-T 载体并转化E.coli DH5α，于氨苄青霉素（ampicillin，Amp）培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌落进行PCR 鉴定，将菌落PCR 检测的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定。

1.4 CmCAT 基因序列的生物信息学分析

通过软件DNAMAN6.0 查找序列的ORF，并将其翻译为氨基酸序列；通过在线NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast 进行核苷酸序列和氨基酸序列相似性分析；应用ClustalX1.81 和ESPript3.0软件对其编码蛋白进行多重对比分析；运用在线蛋白分析工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）对其编码蛋白的理化性质进行预测分析；利用工具ScanProsite（http：//prosite.expasy.org/scanprosite）对其编码蛋白的功能位点及功能域进行预测分析；利用软件MEGA6.05 进行系统进化树分析。

1.5 原核表达载体的构建及鉴定

根据前期克隆获得的CmCAT 基因CDS 序列，设计一对含酶切位点的引物CmCAT-EcoRI-F：5'-CGGAATTCATGGATCCCTACAAGTACCG-3'（下划线为EcoRI 酶切位点），CmCAT-XhoI-R：5'-CCGC TCGAGTCACATTGTTGGCCTCAC-3'（下划线为XhoI酶切位点）。以pMD19-T-CmCAT 质粒为模板，进行PCR 扩增，扩增条件同1.3。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，进行纯化回收。回收产物与pET-28a 载体质粒均进行EcoRI 和XhoI 双酶切，酶切产物纯化回收后，使用T4 DNA 连接酶16 ℃连接12 h。连接产物转入大肠杆菌BL21（DE3），于卡那霉素（kanamycin，Kan）培养基上进行抗性筛选，挑取单个菌落于LB 液体培养基扩增培养后进行PCR鉴定，提取鉴定正确的菌液质粒，对质粒进行EcoRI和XhoI 双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定。

1.6 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE 检测

将测序正确的重组质粒转化表达宿主菌BL21（DE3）。挑取含有pET28a-CmCAT 重组质粒的BL21（DE3）单菌落，接种于含有Kan（50 μg/mL）LB液体培养基中，37 ℃（200 r/min）过夜振荡培养。次日按1∶100 的接种量进行扩增培养，当菌液OD600值约为0.6～0.8 时，分别进行不同条件的诱导。首先利用不同浓度IPTG（终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）诱导3 h，收取1 mL 菌液进行SDS-PAGE检测；以上述最优IPTG 浓度进行诱导时间（1、2、3、4、5、6 h）的优化。

最后以最优IPTG 浓度和最优诱导时间进行不同温度（25 ℃、30 ℃、37 ℃）的诱导优化并进行诱导蛋白的可溶性分析。收集1 mL 菌液于1.5 mL 离心管中，12 000 r/min 离心10 min，取沉淀，加入100 μL PBS（pH7.4）悬浮菌体，12 000 r/min 离心1 min，收集菌体，再次加入60 μL PBS（pH 值7.4）悬浮菌体后，4 ℃超生破碎，12 000 r/min 离心10 min。收集超声破碎后的上清液和沉淀（加入60 μL 8 mol/L尿素重悬，4 ℃螯合30 min）。分别加入4×蛋白上样缓冲液20 μL 混匀，煮沸10 min，冰上冷却后，12 000 r/min 离心10 min，取10 μL 上清进行SDSPAGE（5%浓缩胶，12%分离胶）电泳检测。所有的SDS-PAGE 电泳检测均以pET28a-BL21（DE3）以及未诱导的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）作为对照。

2 结果与分析

2.1 板栗CmCAT 基因全长cDNA 的扩增与克隆

使用CmCAT-F 和CmCAT-R 特异性引物，对CmCAT 基因完整阅读框（ORF）进行RT-PCR 扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现一条约为1 500 bp 的单一条带，通过pMD19-T 克隆测序，发现获得了长度为1 479 bp 的CmCAT 基因片段（见图1）。

图1 CmCAT 基因PCR 扩增电泳图Figure 1 The electrophoresis of PCR product of CmCAT gene

2.2 板栗CmCAT 基因的核苷酸序列分析

板栗CmCAT 基因全长cDNA 序列为1 479 bp，通过ORF Finder 在线软件进行分析，发现该序列为一个完整的阅读框，无5'非编码区和3'非编码区，编码492 个氨基酸（见图2），将该基因cDNA 序列提交NCBI 数据库，注册登录号：KY312851。CmCAT基因核苷酸序列在GenBank 中进行序列相似性对比，结果显示该序列与核桃（Juglans regia，XM_01 8980866.1）CAT 基因序列一致性最高，为85%，与毛果杨（Populus trichocarpa，XM_002301884.1）、茶（Camellia sinensis、KR819178.1）、萝卜（Raphanus sativus，AF031318.2）等多种植物CAT 基因序列一致性均在77%以上。表明克隆获得的CmCAT 基因属于板栗过氧化氢酶基因家族成员之一。

2.3 板栗CmCAT 蛋白的氨基酸序列分析

图2 CmCAT 基因cDNA 序列及其所推导的氨基酸序列Figure 2 cDNA sequence of CmCAT gene and its deduced amino acid sequence

利用ExPASy ProtParam tool 对CmCAT 蛋白质序列进行相关信息分析，预测CmCAT 蛋白分子质量为56.883 kDa；理论pI 为5.83；在组成CmCAT 蛋白的所有氨基酸中，精氨酸（Arg）为使用频率最高的氨基酸，占总氨基酸量的8.1%，半胱氨酸（Cys）为使用频率最低的氨基酸，占总氨基酸量的1.0%；其含有61个负电性氨基酸残基（Asp + Glu），59 个正电性氨基酸残基（Arg + Lys），分子式为C2550H3865N719O736S16；预测不稳定指数为36.20，属于稳定性蛋白；脂肪族氨基酸指数69.15；总平均疏水指数-0.586，属于亲水性蛋白。使用ClustalX1.81 与ESPript3.0 软件并结合BlastP 对CmCAT 蛋白序列进行多序列相似性分析，结果显示（见图3），CmCAT 蛋白序列与蔓花生（Arachis duranensis，XP_015934030.1）等多种植物CAT 蛋白序列同源性达到82%以上。通过Blastp 和ScanProsite 工具对CmCAT 蛋白功能域进行分析，均发现其含有catalase 保守结构域，位于序列第14-492 位氨基酸之间。可见，CmCAT 属于CAT 蛋白家族成员之一。通过在线工具Motif 发现，CmCAT 蛋白还具有2 个重要的功能位点，分别是过氧化氢酶近端活性位点（catalase proximal active site signature），位于第54-70 位氨基酸之间，序列为FERERIPERVVHARGAS；过氧化物酶近血红素位点（catalase proximal heme-ligand signature），位于第344-352 位氨基酸之间，序列为RIFAYGDTQ（见图2）。进一步说明CAT 蛋白在进化过程中是较为保守的，CmCAT 蛋白与其他植物的CAT 蛋白结构和功能是较为相似的。

2.4 板栗CmCAT 蛋白的进化分析

为了解不同植物CAT 间的进化关系，从NCBI数据库下载了23 个物种CAT 氨基酸序列，利用MEGA6.05 软件，采用邻接法，重复检测1 000 次，构建其与CmCAT 氨基酸序列之间的进化关系（见图4）。系统进化树分析结果表明，24 个物种CAT 聚集为两大类群，草本植物CAT 聚为一簇，木本植物CAT 聚为一簇，符合植物的生物进化规律。板栗CmCAT 与核桃JrCAT 同为一个分支，亲缘关系最近，推测它们可能由同一个祖先进化而来。其次，与蔷薇科（Rosaceae）植物亲缘关系较近，而板栗CmCAT 与葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜、黄瓜、丝瓜等植物亲缘关系较远。

图3 CmCAT 与其他植物CAT 蛋白质序列多重对比Figure 3 Sequence multialignment of the deduced CmCAT protein with other plant CAT proteins

图4 Neighbor-joining（NJ）方法构建CmCAT 蛋白与其他植物CAT 蛋白的系统进化树Figure 4 Neighbor-joining （NJ） method to build CmCAT protein and other plant CAT protein phylogenetic tree

2.5 重组表达载体的构建

以pMD19-T-CmCAT 质粒为模板，使用CmCAT-EcoRI-F/CmCAT-XhoI-R 引物扩增获得带酶切位点的CmCAT 基因片段，将PCR 产物纯化回收后与pET-28a 载体分别进行EcoRI/XhoI 双酶切，分别回收目的片段与载体酶切产物并进行连接转化，挑取单菌落进行PCR 鉴定（见图5），条带与预期大小一致；提取PCR 鉴定正确的阳性菌液质粒，进行双酶切验证（见图6），获得预期大小的酶切片段。将验证正确的阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定，测序结果比对发现，CmCAT 基因片段与pET-28a 载体成功连接，表明pET28a-CmCAT 重组表达载体构建成功。

2.6 板栗CmCAT 蛋白的原核表达

挑取pET28a-CmCAT-BL21（DE3）单菌落过夜培养作为母液。在37 ℃下进行不同IPTG 浓度诱导表达6 h，以未诱导的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）、pET28a-BL21（DE3）以及诱导的pET28a-BL21（DE3）（IPTG 终浓度为0.6 mmol/L，诱导3 h）空载体作为对照。结果表明，对照组无目的蛋白表达，实验组在各IPTG 浓度下均能诱导大量表达，组间表达量并无多大差异，分子量约为60 kDa，与预期大小一致（见图7）。因此，以终浓度0.2 mmol/L 作为IPTG 最优诱导浓度。

图5 pET28a-CmCAT-DH5α PCR 检测Figure 5 PCR detection of pET28a-CmCAT-DH5α

图6 pET28a-CmCAT 双酶切鉴定Figure 6 Double enzyme identification of pET28a-CmCAT

使用上述最优表达条件（37 ℃、0.2 mmol/L IPTG），对pET28a-CmCAT-BL21（DE3）最优表达时间进行进一步优化。将OD600 值为0.6～0.8 区间的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）菌液在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG 下进行不同时间的诱导（分别为诱导1、2、3、4、5、6 h）。从图8中可以看出，随着诱导时间的增加，目的蛋白的量也在逐渐增加，诱导6 h 获得的目的蛋白量最大。而对照中载体与pET28a-CmCATBL21（DE3）未诱导均未有目的蛋白出现。因此，以诱导6 h 作为pET28a-CmCAT-BL21（DE3）在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG 下最优诱导时间长度。

最后对pET28a-CmCAT-BL21（DE3）进行不同温度（25 ℃、30 ℃、37 ℃）诱导，同时检测表达的目的蛋白的可溶性。SDS-PAGE 蛋白电泳分析显示，3个温度下均有大量目的蛋白出现，且对照无此条带（见图9），在30 ℃下诱导获得的目的蛋白最为丰富。在上清中无明显目的蛋白出现，其主要以包涵体的形式存在。

图7 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）诱导浓度优化Figure 7 Concentration optimization of pET28a-CmCATBL21（DE3） IPTG induction

图8 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）诱导时间优化Figure 8 Induction time optimization of pET28a-CmCATBL21（DE3）

图9 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）诱导温度优化及可溶性检测Figure 9 Optimization of the induction temperature of pET28a-CmCAT-BL21（DE3）and its solubility detection

3 讨论与结论

植物中复合抗氧化防御体系主要由抗氧化酶组成。其中，CAT 是第一个被发现和描述的[12]。植物遭受病原微生物侵染后会产生大量的H2O2[19]，而H2O2的积累会对植物组织、细胞产生巨大的伤害。CAT 对H2O2具有较高的亲和性[20]，能有效清除过多的H2O2，在防御逆境胁迫和维持植物细胞氧化还原平衡方面具有重要的意义[21]。通过RT-PCR 方法，成功克隆出板栗CmCAT 基因，该基因全长1 479 bp，为一个完整的ORF，编码492 个氨基酸。Blast 分析表明，CmCAT 基因核苷酸序列及氨基酸序列与其他植物的CAT 基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性分别在77%和82%以上，显示其较高的保守性。Motif Scan 分析显示，CmCAT 蛋白序列具有CAT 蛋白家族的catalase 结构域，同时还具有该蛋白家族2个保守的功能位点：过氧化氢酶近端活性位点和过氧化物酶近血红素位点。分析板栗CmCAT 蛋白序列与其他23 个物种CAT 蛋白序列之间的进化关系，发现草本植物和木本植物分为两个大的分支，其中板栗与核桃的亲缘关系最近，与葫芦科草本植物亲缘关系最远。

利用基因工程技术成功获得pET28a-CmCAT重组载体，并转入大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG 诱导后获得分子量约为60 kDa 的目的条带，比预测的CmCAT 蛋白分子量（56.883 kDa）略大，pET28a 载体自带的His-tag 标签序列是造成这种偏差的主要原因之一[22]，同时，诱导获得的目的蛋白与大豆GmCAT 基因在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量大小（60 kDa）一致[23]。随后从IPTG 浓度、诱导时间及诱导温度方面进行最优诱导条件的筛选，以期获得更大量的目的蛋白。通过SDS-PAGE 电泳分析发现，30 ℃，0.2 mmol/L IPTG 诱导表达菌株6 h 获得的目的蛋白量最大，但主要以包涵体的形式存在，且在诱导温度降低的条件下（25℃）仍为包涵体。大肠杆菌已经成功地用于表达来自细菌和低等真核生物的活性重组CAT[24]。然而，利用大肠杆菌系统尚未得到可溶性植物CAT 重组蛋白[25]。陈金峰等[23]将大豆3 个CAT 基因连接pET28a 载体后，转入大肠杆菌进行融合表达，获得的融合蛋白也均为包涵体。彭丹等[26]发现，盐穗木CAT 基因在BL21（DE3）中，通过低温诱导能获得可溶性的目的蛋白，但表达量较低。其所用的表达载体为pET32a，可能对植物CAT 基因在大肠杆菌中的可溶性表达具有一定的促进作用。N.Engel 等[25]发现，昆虫细胞系能够作为获得植物来源的活性重组CAT 的替代方法。作为真核生物，昆虫细胞系在遗传上更相容，可以提供足够的蛋白质折叠机器（分子伴侣）的支持，以及足够的血红素代谢池，并入新合成的重组血红素蛋白。

本研究成功从板栗中克隆了一个CAT 基因，通过多种生物信息学软件分析了CmCAT 基因的同源性、蛋白结构以及分子进化等相关信息，初步分析了CmCAT 基因在不同条件下的原核表达情况，为深入研究CmCAT 基因的功能和揭示板栗抗病过程中的分子机制奠定了基础。