扇贝壳堆积场中产蛋白酶放线菌的选育和鉴定

张志康，闫静静，赵鹏，程显好

（鲁东大学 农学院，山东烟台 264025）

鱼、虾、贝、藻等海产品中所含的蛋白质、矿物质及维生素是陆生生物所不能比拟的，海洋生物中含有大量对人体有益的生物活性物质。甲壳素是海洋生物中含量丰富且具有重要生物活性的一种天然多糖，甲壳素及其衍生物已在许多领域得到广泛的应用，尤其是在医疗和药物制剂方面。另外，甲壳素作为功能性健康食品，具有明显的抗癌、降血脂和降血压的作用[1-3]。

人们通常只关注利用海产品本身的营养价值，往往忽视了对生产中残留的虾贝壳的处理，从而对周边环境及海域造成了严重的污染，影响其他养殖业和沿海旅游业的发展。崆峒岛是一个盛产海产品的岛屿，尤其以扇贝生产为主，但由于扇贝壳没有采用合适的方法处理而长年累月地堆积在沿海地带，每到夏秋季节，堆积扇贝壳的区域就会散发出刺鼻的臭味，不仅使崆峒岛空气质量受到影响，也使其旅游业受到极大影响。因此，选择一个能够尽快处理扇贝壳，降低岛屿环境污染的方法迫在眉睫。

本研究通过从扇贝壳堆积场取样，经过梯度稀释、平板涂布、平板划线、产酶菌初筛、复筛等步骤筛选出高产蛋白酶的菌株，利用微生物产生的蛋白酶对扇贝壳内剩余的蛋白质进行初步分解，避免了腐败气味的产生，保护了环境。与此同时，扇贝壳含有丰富的钙质，也可以被进一步被利用，从而带动周边经济的发展。

1 材料与方法

1.1 样品来源

山东省烟台市崆峒岛扇贝壳堆积场。

1.2 实验仪器

超净工作台（苏州安泰）、压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂）、生化培养箱（广东省医疗器械厂）、电子天平（上海精科电子天平厂）、振荡培养箱（哈尔滨东联电子）、pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）、TM-1000, Table top Microscope。

1.3 培养基

1.3.1 斜面及平板培养基

高氏1号培养基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、Na2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、琼脂18～ 20 g、H2O 1 000 mL，pH 7.2～ 7.4。

先用少量冷水将淀粉调成糊状，在火上边搅拌边加水及其他成分，待全部溶化后补足水分至1 000 mL[4]。

1.3.2 筛选培养基

干酪素12 g、Na2HPO4·12H2O 3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.16 g。

1.3.3 理化鉴定培养基

肉汁蛋白胨培养基：蛋白胨5 g、琼脂15～20 g、牛肉浸膏5 g、NaCl 5 g、H2O 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

牛奶培养基：脱脂牛奶1 000 mL，分装每管10 mL，105 ℃高压灭菌30 min，培养放线菌后记录培养基的外观。

马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯300 g、葡萄糖5 g、琼脂20 g、自来水1 000 mL，pH 6.8。将马铃薯切成小方块，加入200 mL水，在常压下蒸45 min，浸汁用细纱布过滤，不要挤残渣。其他营养物溶于150 mL水内，然后加到马铃薯浸汁中，在常压下蒸45 min，将此混合液加水到1 000 mL，标定并过滤，然后加琼脂。

淀粉溶液：可溶性淀粉20 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、KNO32 g、CaCO32 g、H2O 1 000 mL。将淀粉调成糊状再加入沸水，将混合液用常压蒸汽蒸1 h，即得澄清溶液。

LB培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、NaCl 5 g、琼脂 15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2[5]。

1.4 蛋白酶产生菌的分离纯化

1.4.1 制备土壤稀释液

称取10.0 g碎的扇贝壳样品，放入装有90.0 mL无菌水的三角瓶中，得到10-1的稀释液，然后用移液管取1.0 mL稀释液于装有9.0 mL无菌水的大试管内，以次类推，得到10-2～10-7不同稀释倍数的稀释液[6]。

1.4.2 涂布和培养

分别取10-5、10-6、10-7稀释浓度的样品0.2 mL涂布于蛋白酶产生菌选择培养基，每个浓度涂布3个平皿，置于30 ℃恒温箱中倒置培养48 h。

1.4.3 观察与保存

培养2 d、3 d、4 d后，用牙签挑取菌落形态和颜色不一致的菌体点种于酪蛋白鉴别培养基上，置于30 ℃恒温箱中倒置培养48 h。然后将有透明圈产生的菌株接种于斜面培养基中，放在冰箱中保存待用。

1.5 产蛋白酶菌株的筛选

将所得到的试管斜面菌株采用平板划线分离法接种于酪蛋白鉴别培养基上，既达到分离纯化的目的，又起到鉴别和筛选的作用。通过观察水解圈的大小来判断产酶能力的高低，挑取水解圈大的菌落再次接种于斜面培养基上，放在冰箱中保存待用[7-9]。

1.6 菌株鉴定

1.6.1 菌落形态观察及理化鉴定

观察记录所筛菌株的生长情况，包括菌落特征、菌体形态、菌丝形态、孢子形态等。

1.6.2 放线菌显微观察

利用插片法对所筛放线菌的基内菌丝、气生菌丝、孢子形态进行观察。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

从扇贝堆积场采集4份样品，应用梯度稀释法进行培养，然后挑取30个单菌落于酪素选择性平板上培养48 h，挑取水解圈直径与菌落直径比之大于2的菌落进行斜面保藏。其中发现8株产酶较高，将这8株分别编号为SF1～SF8。结果见表1，图1、图2。

表1 扇贝壳堆积场产蛋白酶菌株菌落直径和水解透明圈直径

2.2 菌株鉴定

菌株（SF1、SF2、SF5、SF6）的基内菌丝、气生菌丝、孢子丝观察如图3～6，表2。

图1 SF1～4在酪素选择性培养基上的透明圈

图2 SF5～8在酪素选择性培养基上的透明圈

图3 SF1孢子丝（10 000倍扫描电镜下观察）

图4 SF2气生菌丝及孢子丝（10 000倍扫描电镜下观察）

图5 SF5气生菌丝及孢子丝（10 000倍扫描电镜下观察）

图6 SF6气生菌丝及孢子丝（10 000倍扫描电镜下观察）

2.3 菌落形态观察及理化鉴定

菌株的生理生化特征如表3所示。

表2 扇贝壳堆积场产蛋白酶菌株菌丝及孢子丝形态特征

表3 菌株的生理生化特征

根据Bergery氏放线菌分类手册中菌落特征及生理生化特征，可初步鉴定菌株SF1为诺卡氏菌属，SF2～SF8属于链霉菌属。诺卡氏菌属和链霉菌属相近，但一般不产生气生菌丝体，且以盛产抗生素为名。链霉菌属的种具有发育良好的菌丝体，但有的种在生长后期气生菌丝体会慢慢退化或者分裂产生孢子，菌丝体不形成横隔膜，且一般具有较强的蛋白质分解能力。

3 讨论

本研究从废弃的扇贝壳中分离得到8株产蛋白酶的放线菌，由菌落特征及生理生化特征可初步鉴定放线菌SF1属于诺卡氏菌属，SF2～SF8属于链霉菌属。蛋白酶是一类水解酶，在鱼、肉加工工业废水处理中已得到了广泛应用。通过产酶微生物发酵可得到相应的酶制剂，该酶制剂应用于崆峒岛扇贝壳的处理中，可加快废弃贝壳的处理过程，使崆峒岛的环境得到一定程度的改善。

与国外相比，我国酶工程在环境污染治理方面的研究与开发仍有较大差距，特别是在高产菌株的选育、酶制剂的制备工艺、产品质量等方面。在固定化酶和固定化细胞的研究与开发也需加强，并争取能较广泛地用于污染治理。

在基因工程、蛋白质工程等方面，我国已开展了改造酶、开发新酶的研究、生物传感器的研究，也取得一些进展。利用酶制作的生物传感器在环境污染监测中应用越来越广泛，酶在废物处理及资源化过程中正在发挥重要作用，利用基因工程和蛋白质工程扩展酶的代谢途经，是治理难降解有毒污染物的重要方法[11-12]。