黔产朱砂莲多酚含量及其抗氧化活性研究
2019-05-13苟体忠刘玉林
苟体忠,刘玉林
(凯里学院 大健康学院，贵州 凯里 556011)
朱砂莲为马兜铃科马兜铃属植物朱砂莲(Aristolochia tuberosa C.F.Liang et S.M.Huang)(AT)的块根。分布于贵州、四川、湖北、广西、云南等地[1]。朱砂莲主要的化学成分为马兜铃酸、生物碱、朱砂莲素和朱砂莲苷[1]，具有清热解毒、消肿止痛等功效[2]，黔东南州苗族和侗族主要用于治疗喉痛、胃痛、肺痨、痢疾、蛇伤等。
多酚类物质是植物的重要次生代谢产物，主要有酚酸、黄酮类、木脂素类和单宁[3]。天然源的多酚具有多种生物活性，如抗癌[4]、阿尔兹海默症[5]、抗氧化[6]、清除自由基[6]等。植物多酚类物质的抗氧化活性一直是国内外学者研究的热点，然而，朱砂莲多酚类物质的抗氧化活性研究尚未见文献报道。因此，本文以朱砂莲为研究对象，考察朱砂莲中酚类物质的还原能力和1，1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)清除率，以便为朱砂莲酚类物质的利用提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
朱砂莲(Aristolochia tuberosa C.F.Liang et S.M.Huang)(AT)采自贵州省凯里市雷山县。特丁基对苯二酚(TBHQ)、福林酚试剂、1，1-二苯-2-苦基肼自由基(DPPH·)、芦丁标准品(批号：250249-75-3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、没食子酸标准品(批号：5995-86-8，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
1.2 仪器与设备
紫外-可见分光光度计(UV-2550，日本岛津公司)；超声波清洗机(WH-300，济宁万和超声电子设备有限公司)；离心机(TD5M，长沙湘智离心机仪器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 朱砂莲酚类物质的提取
称取2g朱砂莲粉末样品于50 mL离心管中，加入40 mL 70%的乙醇溶液，超声提取30 min，离心，上层清液转移至100 mL容量瓶中，用上述步骤将滤渣再处理1次，并用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，待测。
1.3.2 没食子酸标准曲线的制备
采用Folin﹠ciocalteu's 比色法[7]测定，准确称取没食子酸粉末125 mg于1000 mL容量瓶中，并用超纯水定容至刻度，得0.125mg·mL-1标准溶液。用移液枪分别吸取1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 ，5.0 mL的标准溶液于5个25 mL比色管中，依次加入福林酚试剂1.0 mL、10% Na2CO3溶液6.0 mL，并用超纯水定溶至刻度，摇匀，置于暗室中2 h，并在760 nm波长下测定其吸光度值。以没食子酸浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为：A=115.62C+0.025，r=0.9999。
1.3.3 朱砂莲总多酚的测定
取朱砂莲提取液0.2 mL于25mL比色管中，按1.3.2步骤测定其吸光度，并根据线性回归方程计算提取液总多酚的浓度，再由如下公式计算朱砂莲总多酚的含量。
朱砂莲总多酚含量(mg·g-1)=(C×VB×VT)·(VR×W)-1
式中：C为反应体系溶液的总多酚浓度(mg·mL-1)；VB为比色管量程(25mL)；VT为提取液总体积(100mL)；VR为反应体系中提取液体积(0.2 mL)；W为朱砂莲质量(g)。
1.3.4 芦丁标准曲线的制备
采用硝酸铝比色法测定[8]，准确称取0.26 g芦丁于1000 mL容量瓶中，并用70%乙醇溶液定容至刻度。分别吸取该标准溶液1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0 ，5.0 mL于5个25 mL比色管中，加入0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min。加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min。加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，摇匀，放置15 min，并在510 nm波长处测定其吸光度。以芦丁浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为A=11.88C+0.0042，r=0.9999。
1.3.5 朱砂莲总黄酮的测定
取朱砂莲提取液0.2 mL于25mL比色管中，按1.3.4步骤测定其吸光度，并根据线性回归方程计算提取液总黄酮的浓度，再由如下公式计算朱砂莲总黄酮的含量。
朱砂莲总黄酮含量(mg·g-1)=(C×VB×VT)·(VR×W)-1
式中：C为反应体系溶液的总黄酮浓度(mg·mL-1)；VB为比色管量程(25mL)；VT为提取液总体积(100 mL)；VR为反应体系中提取液体积(0.2 mL)；W为朱砂莲质量(g)。
1.4 朱砂莲总多酚抗氧化活性测定
1.4.1 还原能力
取0.2 mL不同浓度的提取液，并依次加入 pH值=6.6 的磷酸盐缓冲液2.5 mL和1% 的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，摇匀，置于50 ℃水浴振荡器中振荡20 min。然后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，摇匀，取混液 2.5 mL，再加入超纯水2.5 mL和 0.1%的氯化铁溶液2.5 mL，摇匀，静置 10 min，在 700 nm处测定其吸光度(As)，以超纯水代替提取液作为空白并测定其吸光度 A0。则还原能力ΔA=As-A0，ΔA其值越大，提取液的还原能力越强[9]。
1.4.2 DPPH·清除率
在比色管中依次加入2×10-4mol·L-1DPPH·溶液2 mL 和不同浓度的提取液2mL，摇匀并置于暗室中30 min，以无水乙醇为参比液，在517 nm处测定其吸光值As，以无水乙醇溶液代替提取液作为空白并测定其吸光值A0。根据下式计算样品溶液对DPPH·的清除率：
1.4.3 半抑制浓度IC50的计算
采用SPSS17.0计算IC50，IC50表示清除率为50%所对应的浓度，其值越小，说明清除能力越强。
1.5 数据处理
运用SPSS17.0、Origin8.0软件进行数据统计分析。
2 结果与讨论
2.1 朱砂莲总多酚的含量
按1.3.2节测定朱砂莲提取液中总多酚含量，其值为(87.47±0.21)mg·g-1。
2.2 朱砂莲总黄酮的含量
按1.3.3节测定朱砂莲提取液中总黄酮含量，其值为(245.00±0.50)mg·g-1。
2.3 朱砂莲总多酚抗氧化活性分析
2.3.1 朱砂莲总多酚对还原能力的影响
朱砂莲总多酚(AT)及其对照组(TBHQ)还原能力测定结果见图1。图1可知，还原能力随朱砂莲总多酚和TBHQ浓度的增加而逐渐增强，且朱砂莲总多酚的还原能力明优于TBHQ。其次，朱砂莲总多酚浓度与还原能力之间显著的正相关关系也表明在朱砂莲中的主要抗氧化活性成分为酚类物质[21]。
图1 朱砂莲总多酚对还原能力的影响，不同小写字母表示差异显著水平(α<0.05)
Fig.1 Effection of total polyphenol on total antioxidant power from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level
2.3.2 朱砂莲总多酚(AT)对DPPH·清除能力的影响
朱砂莲总多酚(AT)及其对照组(TBHQ)DPPH·清除能力见图2。图2可知，朱砂莲总多酚的DPPH·清除能力明显优于TBHQ。同时，朱砂莲总多酚浓度与DPPH·清除率之间较高的正相关关系也表明在朱砂莲中的主要抗氧化活性成分为酚类物质[11]。此外，朱砂莲总多酚的IC50值(0.004 g·L-1)远小于TBHQ 的IC50值(0.024 g·L-1)，也小于其他中草药的IC50值，如：黄芪[12](IC50=0.017 g·L-1)、铁皮石斛[13](IC50=0.395 g·L-1)、枸杞[14](IC50=0019 g·L-1)、柿叶[15](IC50=0.85 g·L-1)、地榆[16](IC50=0.691 g·L-1)、蛇莓(0.018 g·L-1)[17]、果上叶(0.022 g·L-1)[18]等。分析认为，朱砂莲总多酚具有较强的DPPH·清除能力。
图2 朱砂莲总多酚对DPPH·清除能力的影响，不同小写字母表示差异显著水平(α<0.05)
Fig.2 Effection of total polyphenol on DPPH· scavenging rate from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level
2.4 朱砂莲总黄酮抗氧化活性分析
2.4.1 朱砂莲总黄酮对还原能力的影响
朱砂莲总黄酮(AT)及其对照组(TBHQ)还原能力分析结果见图3。图3可知，还原能力随朱砂莲总黄酮和TBHQ浓度的增加而逐渐增强，但朱砂莲总黄酮的还原能力略低于TBHQ。此外，朱砂莲总黄酮浓度与还原能力之间较高的正相关关系也表明在朱砂莲中的主要抗氧化活性成分为黄酮类物质。
图3 朱砂莲总黄酮对还原能力的影响，不同小写字母表示差异显著水平(α<0.05)
Fig.3 Effection of total flavonoids on total antioxidant power from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level
2.4.2 朱砂莲总黄酮对DPPH·清除能力的影响
朱砂莲总黄酮(AT)及其对照组(TBHQ)的DPPH·清除能力见图4。图4可知，朱砂莲总黄酮的DPPH·清除能力略低于TBHQ。此外，朱砂莲总黄酮浓度与DPPH·清除率之间较高的正相关关系，表明在朱砂莲中的主要抗氧化活性成分为黄酮类物质。同时，朱砂莲总黄酮的IC50值0.24 g·L-1)略大于TBHQ 的IC50值0.14 g·L-1)，但小于其他中草药总黄酮的IC50值，如：银杏叶[9](IC50=3.45 g·L-1)、黄芪[19](IC50=12.01 g·L-1)、藤茶[20](IC50=3.32 g·L-1)、铁包金[20](IC50=36.41 g·L-1)、贡菊[21](IC50=0.323 g·L-1)等。分析认为，朱砂莲总黄酮具有较强的清除DPPH·的能力。
图4 朱砂莲总黄酮对DPPH·清除能力的影响，不同小写字母表示差异显著水平(α<0.05)
Fig.4 Effection of total flavonoids on DPPH· scavenging rate from Aristolochia tuberosa，different lower cases mean significantly different at 0.05 level
3 结论
朱砂莲总多酚和总黄酮的含量均较高，其值分别为(87.47±0.21)mg·g-1和(245.00±0.50)mg·g-1；朱砂莲总多酚还原能力和DPPH自由基清除率高于TBHQ，但朱砂莲总黄酮还原能力和DPPH自由基清除率小于TBHQ；朱砂莲总多酚清除DPPH自由基的IC50值0.004 g·L-1)小于总黄酮IC50值0.24 g·L-1)；朱砂莲总多酚与总黄酮浓度与还原能力和DPPH自由基清除率之间均呈显著正相关关系。结果表明，朱砂莲中抗氧化活性物质主要是酚类和黄酮类成分，且朱砂莲总多酚和总黄酮均具有较强的自由基清除能力和还原能力，是天然的自由基清除剂和抗氧化活性剂。
