枸橼酸西地那非原料药新的未知杂质的发现与合成

李淑恒, 宋煜伟，申鹏翠, 董静静, 潘会歌

(1.新乡制药股份有限公司 药物研究所,河南 新乡 453000;2. 洛阳职业技术学院 食品药品学院，河南 洛阳 471000)

枸橼酸西地那非药品标准已经列入欧洲药典(EP),美国药典(USP)和印度药典(IP)，目前明确了的有关物质2有：合成工艺控制中残留的3个有关物质，分别为1-甲基-3-丙基-4-氨基吡唑-5-甲酰胺(盐酸盐)，1-甲基-3-丙基-4-(2-乙氧基苯甲酰基)吡唑-5-甲酰胺(Ⅰ)，1-甲基-3-丙基-5-(2-乙氧基苯基)-6,7-二氢-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(Ⅱ)。药典规定的其他有关物质有：5-[(2-乙氧基-5-(4-甲基哌嗪-1-磺酰基)苯基]-1-甲基-3-(2-甲基丙基)-1,6-二氢吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(Ⅲ)，3-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6,7-二氢-1H-吡唑并[4,4-d]嘧啶-5-基)苯磺酸(Ⅳ)，1-[(4-乙氧基-3-[5-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶)]苯磺酸基〗-4-甲基哌嗪-4-氧化物(Ⅴ)，5-[(2-羟基-5-(4-甲基哌嗪-1-磺酰基)苯基]-1-甲基-3-丙基-1,6-二氢吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(Ⅵ)，结构式详见图1。

在我公司枸橼酸西地那非的实验中，高效液相色谱检测枸橼酸西地那非过程中，存在一个未知杂质(以下均简称Imp2-1)，此杂质非图1所示的有关物质，并且作为枸橼酸西地那非原料药的最大单杂存在，高于药典规定的单杂控制限度。因此对Imp2-1的研究以此展开,确保药物安全有效，对该杂质的定性与含量控制应受到重视。

1 实验

1.1 仪器与试剂

Waters2695高效液相色谱仪，Waters2695质谱联用仪及empower 数据处理工作站(美国沃特世科技有限公司)；核磁共振仪bruker DPX-40M(德国布鲁克科技有限公司)；perkin elmer spectrum two红外光谱仪(铂金埃尔默公司)；旋转蒸发器(郑州长城科工贸有限公司)；循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。

图1 有关物质的结果

Fig.1 structures of related substance

1-甲基-3-正丙基-4-氨基吡唑-5-甲酰胺盐酸盐(盐酸盐)、氯磺酸、N-甲基哌嗪、乙酸乙酯、三乙胺、氢氧化钾、无水乙醇、碳酸氢钠、一水合柠檬酸、二氯甲烷、色谱级乙腈、色谱级甲醇、去离子超纯水。

1.2 枸橼酸西地那非原料药的合成工艺

枸橼酸西地那非原料药的合成方法报道较多[3-11]。方法大同小异，必需原料与反应路径相同。

一般的合成方法如图2：(1)将盐酸盐、乙酸乙酯，三乙胺投入反应瓶， 10℃以下慢慢滴加邻乙氧基苯甲酰氯，抽滤干燥得Ⅰ。(2)将Ⅰ、氢氧化钾和无水乙醇投入三颈烧瓶回流，反应液降至室温盐酸调节pH值至 ，抽滤干燥得Ⅱ。 (3)将氯磺酸滴加入反应瓶， 10℃以下分批缓慢加入Ⅱ， 30℃反应。反应结束后，将反应液缓慢倒入冰水和二氯甲烷的混合液中搅拌分层，有机相Ⅳ收入反应瓶中，滴加N-甲基哌嗪，反应液用饱和碳酸氢钠溶液、去离子超纯化水分别萃取一次，有机相减压蒸馏得西地那非。酸，乙醇，西地那非至三颈烧瓶中回流，降温结晶抽滤，得枸橼酸西地那非粗品。枸橼酸西地那非粗品经活性炭， %乙醇回流精制，得枸橼酸西地那非成品。

图2 枸橼酸西地那非的合成路线

Fig.2 Synthetic Route of sildenafil citrate

1.3 Imp2-1的研究

在该合成工艺下，枸橼酸西地那非成品中检测出杂质Imp2-1，液相百分比高于0.1%。在本研究发现Imp2-1之前，依据欧洲药典中所列的枸橼酸西地那非有关物质检测项下的HPLC条件，在该HPLC条件下，Imp2-1保留时间靠后而未被检测出，为此本研究制定了一个针对Im2-1的HPLC条件。经过HPLC保留时间对比，Imp2-1在中间体Ⅱ中已经存在(含0.2%左右，见图3)，经过后续第3步反应，生成产物Ⅳ的二氯甲烷萃取液中，Imp2-1在薄层色谱上清晰可见。在第3步反应的基础上，Ⅱ在改变氯磺酸用量以及反应温度的体系中，所得产物Ⅳ中，Imp2-1的液相百分比可提升至15%，接着对Ⅳ进行质谱分析，得Imp2-1分子质量为346.9。由于第2步与第 步反应产物都存在Imp2-1，而两步反应唯一相同的元素为体系里都含有氯化氢(氯磺酸分解产生H2SO4和HCl)。最终推测出Imp2-1的结构可能为5-(5-氯-2-乙氧苯基)-1-甲基-3-丙基-1,6-二氢-7H-吡唑[4，3-d]嘧啶-7-酮。

图3 Imp2-1和中间体Ⅱ HPLC峰综合报告

Fig.3 Peak Comprehensive Report of HPLC of Imp2-1 and Ⅱ

2 Imp2-1的合成及结构表征

2.1 Imp2-1的合成

具体的合成方法如图4：将10gⅡ、100mL氯仿投入三口瓶1中，加入1mL氯磺酸搅拌均匀；10g高锰酸钾投入三颈烧瓶2中，恒压滴液漏斗中加入60mL盐酸装与三颈烧瓶2，三颈烧瓶1与三颈烧瓶2之间连起通气管，通气管口应没入氯仿液面以下，设备准备完毕，开启盐酸滴注，观察三口瓶1的气泡，确定盐酸滴注速度，同时开启搅拌并加热回流三颈烧瓶1。当不再有氯气气泡产生时停止反应。用水萃取，减压蒸馏有机相，乙酸乙酯重结晶，干燥得产物1g，液相纯度达97%以上。通过液相保留时间与质谱对比，确认得到的产物为5-(5-氯-2-乙氧苯基)-1-甲基-3-丙基-1,6-二氢-7H-吡唑[4，3-d]嘧啶-7-酮。在没有氯磺酸存在的体系中，直接通入氯气，并不能得到Imp2-1。

图4 Imp2-1的合成路线

2.2 杂质的结构表征

Imp2-1的NMR见表1，IR spectra见图5，LS-MS见图6。

表1 Imp2-1的核磁数据

Tab.1 NMR of Imp2-1

图5 Imp2-1的红外图谱

图6 Imp2-1的液相质谱

2.3 Imp2-1的普遍性

在对Imp2-1研究的同时，我们也购入了其他公司生产的枸橼酸西地那非，其他厂家的产品也同样存在Imp2-1(图7，还有其他厂家的样品同样含有Imp2-1，由于大量图谱的名称以代码形式显示 不具有代表性而未在此图列出)。因为HPLC进样方法采用点样，枸橼酸西地那非主峰高不同，但是已经超出了药典规定的有关物质检测浓度，不影响有关物质及Imp2-1的含量检测。图中可见，其他厂家的Imp2-1明显存在，可见大部分生产厂家也是在本文列出的工艺下生产的。本公司实验室小试产品为枸XDNF2#，通过工艺改进(工艺涉嫌机密，无法列出)，已将Imp2-1彻底除去，并将Imp2-1列入了枸橼酸西地那非成品的质量标准中加以控制。

图7 枸橼酸西地那非HPLC峰综合报告

Fig.7 Peak Combrehensive Report of HPLC sildenafil citrate

3 总结

Imp2-1未见报道，研究表明Imp2-1是由体系中存在HCl而产生的,而氯磺酸是工艺中必不可少的原料，氯磺酸自身在其磺化反应过程中会产生大量HCl。由此可以推论在有氯磺酸作为原料参与的枸橼酸西地那非合成工艺中，必然会产生Imp2-1。若Imp2-1无法有效的除去，会掺杂在枸橼酸西地那非成品中，影响枸橼酸西地那非原料药纯度以及可能作为药品在人体引起毒副作用。故Imp2-1应作为杂质定入枸橼酸西地那非成品的质量标准中控制其含量，保证药品的质量安全。