晚期肺癌患者血清EGFR基因突变状态及临床特征*

向 玉， 刘玉林， 吕姣姣， 胡 容， 赵琪林**, 吴晓伟

(1.遂宁市中心医院 检验科, 四川 遂宁 629000； 2.西安交通大学第一附属医院 呼吸科， 陕西 西安 710061)

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因是晚期非小细胞肺癌患者较为常见的易突变基因，治疗EGFR基因突变型肺癌患者的一线药物为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)[1-3]。统计结果显示，我国仅有少部分肺癌患者在选择治疗方式之前进行EGFR基因突变检测，而导致这种情况的主要原因之一即肿瘤组织的获取十分困难。因此，在不需要患者肿瘤组织的前提下，即可对EGFR基因的突变状态进行检测，能够有效提高我国肺癌患者EGFR基因状态检测率，有助于治疗方案的制定。研究证实，肺癌患者外周血中肿瘤DNA水平高于健康人群，对血清与肿瘤组织样本中EGFR水平进行比较发现二者一致性高达60%～95%[4-6]。直接测序作为检测基因突变状态的“金标准”具有准确性高、特异性强的优点，近年来二代测序法逐渐应用于肿瘤易感性以及个性化用药中。为此，本研究以110例非小细胞肺癌患者为研究对象，采用二代测序测定非小细胞肺癌患者血清EGFR基因突变分布情况，并进一步分析EGFR基因突变状态与患者临床特征及EGFR-TKIs治疗效果的相关性，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料及分组

选取2016年12月～2017年6月收治的110例非小细胞肺癌患者为研究对象，根据二代测序结果，将其分为EGFR突变型患者(EGFR突变组，n=37)和EGFR野生型患者(EGFR野生组，n=73)。

1.1.1入组标准 经细胞学或病理组织学确认的晚期非小细胞肺癌，年龄20～65岁，性别不限，身体一般状况评分(ECOG )为0～3分，存在至少有1处可测量病灶，入组前未接受过任何药物治疗及放疗，临床资料完整者。

1.1.2排除标准 合并主要器官疾病患者，血、尿、大便3大常规检查异常者，存在肝肾功能、心功能严重障碍者，合并其他恶性肿瘤患者，临床资料不全者。

1.2 研究方法

1.2.1样本搜集与DNA提取 全部受试者均于治疗前取5 mL外周静脉血，将所取血样在室温状态下静置2 h，随后置入低温高速离心机中以3 000 r/min离心10 min，取上层血浆置2 mL冻存试管保存于-80 ℃冰箱中待测。血浆内DNA提取采用血液试剂盒(DNeasy，德国Qiagen公司)说明书中要求进行，采用超微量分光光度计(NanoDrop2000， ThermoFisher公司)进行浓度及纯度的检测， DNA样品OD260/OD280值为1.8～2.0。

1.2.2二代测序法测定EGFR基因突变EGFR基因序列参照GenBank公开发表的编号为AY588246的序列，引物设计应用ABI Prism TM Primer Express软件，引物序列见表1，采用聚合酶链式反应(PCR)法分别对EGFR基因第18、19、20、21外显子进行扩增。将PCR扩增产物进行纯化后，采用ABI Ion ProtonTM二代测序仪进行双向测序，应用Chromas软件对测序结果进行分析。对于发生突变或缺失的样本，均采用反向引物进行反向测序以验证。

表1 引物序列Tab.1 List of primer sequences

1.2.3观察指标 (1)采用二代测序技术分析晚期非小细胞肺癌患者EGFR基因突变分布情况；(2)记录并比较两组受试者性别、年龄、癌症类型、TNM分期以及吸烟史等临床特征；(3)采用多元Logistic回归分析非小细胞肺癌患者血清EGFR基因突变状态与其临床病理特征之间的相关性；(4)评价两组受试者治疗效果；(5)比较两组受试者中位无疾病进展生存期(progression free survival，PFS)，PFS的计算方式为患者从开始接受治疗直至疾病进展或尚未进展的最后一次随访时间，本研究以2017年12月31日为随访截止时间；(6)采用电化学发光法应用全自动电化学发光免疫分析仪(Cobas e601，罗氏公司)检测两组受试者癌胚抗原(CA125)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)、糖类抗原(CA19-9)及细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)等血清肿瘤标志物表达水平。

1.2.4疗效评判标准 完全缓解：全部靶病灶均消失且无新病灶出现，肿瘤标志物达到正常水平并持续4周以上；部分缓解：全部靶病灶最大径之和降低不低于30%并为持续4周以上；疾病稳定：全部靶病灶最大径之和增加低于20%或降低不足30%；疾病进展：出现新病灶或原有全部靶病灶最大径之和增加超过20%。总有效率=(完全缓解+部分缓解)/患者总数×100%。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 EGFR基因突变

37例EGFR基因突变患者中共检测出19del、L858R、L861Q、S768I及G719X 5种突变，其中19del、L858R两种突变例数和所占比例较高，分别为17(45.95%)、16(43.24%)，L861Q、S768I、G719X这3种突变例数和所占比例分别为2(5.41%)、1(2.70%)和1(2.70%)。

2.2 一般资料和临床特征

EGFR突变组中，女性患者所占比例明显高于男性，腺癌患者所占比例明显高于非腺癌患者，TNM分期为Ⅲb期患者所占比例明显低于IV期患者，且有吸烟史患者所占比例较低，差异有统计学意义(P<0.05)；EGFR突变组与EGFR野生组患者在性别、癌症类型、TNM分期及吸烟史比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 EGFR基因突变状态与临床病理特征的相关性

多因素Logistic回归分析结果显示，EGFR基因突变状态与非小细胞肺癌患者在癌症类型、性别、TNM分期、吸烟史显著相关(P<0.05)，与年龄无显著相关性，见表3。

2.4 疗效评价

治疗后，EGFR突变组患者临床有效率明显高于EGFR野生组，两组比较差异有统计学意义(χ2=5.873，P<0.05)，见表4。

2.5 PFS

随访结果显示，EGFR突变组PFS为(9.75±1.64)月，EGFR野生组患者PFS为(5.51±0.40)月，EGFR突变组PFS明显高于EGFR野生组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 两组非小细胞肺癌患者一般资料及临床特征比较(n，%)Tab.2 Patient information, EGFR mutation status and clinical features

表3 EGFR基因突变状态与临床病理特征的多元Logistic分析Tab.3 Multivariate logistic analysis of EGFR gene mutation status and clinicopathological features

表4 两组非小细胞肺癌患者临床疗效比较(n，%)Tab.4 The correlation between therapeutic effects and EGFR mutation status

2.6 血清肿瘤标志物

EGFR突变组受试者CEA表达水平明显高于EGFR野生组，CA125、CY21-1及SCC-Ag明显低于EGFR野生组，两组间血清肿瘤标志物表达水平比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 两组非小细胞肺癌患者血清肿瘤标志物表达水平比较Tab.5 The correlation between Serum tumor markers and EGFR mutation status

3 讨论

据统计，在我国乃至全球，肺癌的发病率以及致死率均高居恶性肿瘤之首，肺癌患者中约有85%为非小细胞肺癌，该疾病严重威胁到人们的身体健康甚至生命[7]。以EGFR-TKIs为代表的靶向药物对于存在EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者具有显著的治疗效果，而EGFR基因野生型患者将无法从EGFR-TKIs药物治疗中获益[8-9]。故而，为提高治疗效果，临床上对非小细胞肺癌患者采取治疗措施之前，应该明确其EGFR基因突变状态[10]。EGFR基因突变检测的首选材料为患者的肿瘤组织，然而由于晚期非小细胞肺癌患者的肿瘤组织标本主要是支气管镜活检或肺穿刺的小标本，标本量无法满足基因检测的需要，此外，肿瘤异质性可能会降低活检肿瘤小标本在反映肿瘤整体的基因突变的准确性。近年来，研究人员提出可将血液样本作为基因检测的生物材料，大量研究证实，非小细胞肺癌患者外周血与组织样本中EGFR突变检测结果具有较高的一致性，提示采用二代测序法对非小细胞肺癌患者血清中EGFR基因突变状态进行检测具有较高的可行性[11-13]。

本研究采用二代测序技术对110例晚期非小细胞肺癌患者血清EGFR基因突变状态进行了检测，发现其中EGFR基因突变患者约占33.64%(37例)，与同类型研究结论相一致[14-15]；在EGFR基因突变患者中，共发现5处突变位点，其中19del、L858R两种突变所占比例较高分别为45.95%、43.24%，L861Q突变比例为5.41%，S768I与G719X两种突变所占比例较低，均仅为2.70%、2.70%。临床特征方面研究返现，EGFR基因发生突变患者中，女性所占比例高于男性，腺癌高于非腺癌、无吸烟史者高于有吸烟史者，TNM分期为Ⅲb期者低于IV期者，进一步通过多因素Logistic回归分析结果显示，EGFR基因突变状态与非小细胞肺癌患者癌症类型、性别、TNM分期、吸烟史显著相关(P<0.05)，大量研究指出，EGFR基因是非小细胞肺癌患者的第一代驱动基因，在亚裔、女性、腺癌以及不吸烟患者中突变发生率较高[16-17]，这一结论与本研究结果相一致。

国外研究团队指出，对于EGFR基因突变型的晚期非小细胞肺癌患者，采用EGFR-TKIs药物进行一线治疗的临床有效率和疾病控制率分别为40%和70%，且患者平均PFS超过9个月；另有研究证实，相较于常规化疗方案，血清EGFR基因存在突变的非小细胞肺癌患者采用吉非替尼治疗后的临床效果以及无进展生存期均明显优于接受标准化疗方案更优；研究人员通过对比分析晚期肺癌患者组织及血浆中游离DNA发现，二者在靶向药物临床治疗效果的预测方面具有高度一致性[18-20]。本文研究发现，EGFR突变组患者临床有效率以及PFS均明显高于EGFR野生组，且差异具有统计学意义(P<0.05)，与上述同类型研究结论一致。此外，本研究还发现EGFR基因突变患者与EGFR基因野生型患者间血清肿瘤标志物表达水平具有显著差异(P<0.05)，其机理有待进一步分析。值得注意的是，二代测序法检测血清中EGFR基因突变状态并非适用于全部肺癌患者，这是由于血液肿瘤DNA的水平会受到肿瘤分期的影响，Ⅲ期及Ⅳ期患者血EGFR检出率较高，而对于I、II期患者检测灵敏度较低，这也是本研究选择晚期非小细胞肺癌患者为研究对象的主要原因。

综上所述，EGFR突变状态与非小细胞肺癌患者性别、癌症类型、肿瘤分期以及吸烟史等临床特征以及临床效果、肿瘤标志物表达水平密切相关，二代测序法作为EGFR基因突变状态的重要检测方式，在对患者的临床治疗方面具有重要指导意义。