细胞介导的药物递送系统研究进展

强 磊，李国瑞，宫春爱，台宗光，高 申*

(1.海军军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海 200011)

20世纪70年代人们开创性地将包裹β葡萄糖苷酶的红细胞用于戈谢病(Gaucher’s disease)的治疗[1]，这一研究开启了细胞介导的药物传递新途径。不同的细胞具有不同的生理特征，如红细胞具有长效循环的作用，免疫细胞具有对炎症和肿瘤部位靶向富集的功能[2]，可以利用细胞的这些天然功能将其开发为药物载体。以细胞为基础的药物载体与传统的纳米载药系统相比，具有低免疫原性和毒副作用小的突出优势[3]，成为近年来的研究热点。本文对红细胞、免疫细胞、干细胞和肿瘤细胞作为药物载体的研究进展及细胞的各种载药方式做一综述。

1 用作药物传递系统的细胞类型

目前研究的细胞载体有红细胞、免疫细胞、干细胞和肿瘤细胞(见表1)，现重点介绍各种细胞载药系统的特点、携载制剂及实际应用。

1.1 红细胞 红细胞是一种缺乏细胞器和细胞核的双凹盘状细胞，具有高度可变形性，可作为天然载体将氧气和营养物质运输到全身[4]。将红细胞作为药物载体具有以下优势：(1)红细胞的寿命约为120 d，作为药物储库可以延缓药物释放，延长药物的半衰期。(2)红细胞具有较好的生物相容性，在红细胞的保护下，携载的治疗药物不易被机体免疫系统吞噬和清除。(3)红细胞可被机体完全降解，无毒性产物，免疫原性低。这些特征为红细胞成为药物载体提供了可能性[5]。因红细胞的寿命较长，大量的研究试图将药物连接在红细胞表面，或导入红细胞来增加药物在体内的循环时间。低渗溶胀法是将药物导入红细胞内的一种常用方法。该方法先将红细胞放置在低渗环境中，细胞膜上的孔隙因细胞膨胀被瞬时放大，从而允许药物扩散至细胞中。载药之后将红细胞放入等渗介质中，空隙被重新密封。Ahn等[6]利用低渗溶胀法将金纳米粒导入到红细胞中，用于全身血液的动态X射线成像。但在加载药物的过程中，细胞的结构和膜表面的化学成分会发生变化，导致细胞的正常功能受到影响。为解决这一问题，有研究报道将药物与细胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)通过二硫键共价结合[7]，经CPPs修饰的药物进入红细胞后，二硫键被细胞内高表达的谷胱甘肽降解，药物与CPPs发生解离，这种载药过程不会对红细胞的结构和功能产生影响。在该研究中，以左旋天冬酰胺酶(L-asparaginase,ASNase)为模型药物，分别用低渗溶胀法和CPPs介导的包封法装载ASNase。将两种载药红细胞静脉注射到小鼠体内，观察到低渗溶胀法处理的红细胞其血浆半衰期为5.9 d，而CPPs介导的载药红细胞其血浆半衰期延长为9.2 d。

表1 细胞介导的药物递送系统Table 1 Cell-mediated drug delivery systems

用红细胞制备的红细胞膜最大限度地保留了膜中的蛋白质并复制了表面抗原多样性，具有红细胞的长效循环和免疫逃避能力。红细胞膜上的CD47已被证明是一种“标记物”，它可以通过信号调节的相互作用抑制巨噬细胞的吞噬作用。Ren等[8]通过纳米膜共挤压的方法，将制备的红细胞膜包被在纳米载体的表面，形成仿生红细胞载体。仿生红细胞载体可以有效地减少巨噬细胞(RAW264.7)的摄取并显著延长血液循环时间，实现肿瘤部位的高度富集。此外，静脉注射后可有效抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长。

1.2 免疫细胞 与红细胞相比，免疫细胞是一种更具潜力的药物载体。免疫细胞不仅可以作为药物储库延缓药物的释放，同时还具有主动靶向炎症部位的功能。研究显示，炎症反应在肿瘤的各个阶段都发挥着重要作用，包括肿瘤的起始、增殖、侵袭和转移[9]。肿瘤内部因结构致密、缺乏血管而形成的缺氧微环境是大多数实体瘤的标志性特征。在肿瘤的中心区域常观察到因缺氧引起的坏死区域。因此伴有炎症和坏死的肿瘤部位会分泌大量的趋化因子，招募体内的免疫细胞向肿瘤部位聚集。目前，作为药物载体研究最多的是单核/巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞。

1.2.1 单核/巨噬细胞 单核/巨噬细胞起源于骨髓干细胞，先分化为单核细胞，通过血液循环进入各组织器官后，进一步分化为巨噬细胞。单核/巨噬细胞本身具有较强的吞噬能力，可以直接通过胞吞的方式携载化学药物和载药纳米粒。Fu等[10]通过简单孵育的方法将多柔比星(DOX)加载到鼠源巨噬细胞RAW264.7中，体内活体成像数据显示，巨噬细胞的活力和对肿瘤细胞的靶向性并没有因装载药物而发生明显改变。在小鼠乳腺癌肺转移模型中，装载DOX的巨噬细胞显示出明显的抗癌功效，与生理盐水处理组相比，载药巨噬细胞处理组中小鼠的30 d存活率由25%提高至80%。He等[11]研究发现，单核细胞携载天冬酰胺内肽酶(legumain)敏感纳米粒形成的仿生递药系统，可以主动靶向至体内的肺转移性4T1乳腺癌细胞。该系统中的单核细胞进入转移病灶组织后分化为巨噬细胞，导致细胞内天冬酰胺内肽酶水平升高，天冬酰胺内肽酶敏感的纳米粒被破坏。携载的化疗药物以游离药物或含药外泌体的形式被释放后作用于癌细胞。在小鼠乳腺癌肺转移模型中，载药单核细胞处理组的平均肺转移性结节数量为(17.4±6.9)个，仅为生理盐水对照组的22.2%，结果表明该仿生递药系统能有效抑制转移性乳腺癌的增殖、转移和侵袭。

Cao等[12]从鼠源巨噬细胞系RAW264.7细胞分离细胞膜，并包裹在携载曲妥珠单抗的脂质体表面，形成一种仿生巨噬细胞载体。巨噬细胞除了具有炎症靶向和肿瘤靶向的特性外，还可以通过细胞膜表面的α4整合素和与乳腺癌细胞的血管黏附分子(VCAM-1)主动结合。利用这一特性，可以实现对乳腺癌的主动靶向富集。体外实验显示，仿生巨噬细胞载体可以增加4T1乳腺癌细胞摄取，并对细胞活力有抑制作用。在小鼠体内，仿生巨噬细胞载体能够靶向转移至肿瘤病灶，并对乳腺癌肺转移产生了显著抑制作用。仿生巨噬细胞载体给药组中肺转移结节数为(3.8±2.6)个，是游离药物组的17.6%，载药脂质体组的24%。

1.2.2 中性粒细胞 中性粒细胞是血液中含量最丰富的免疫细胞，也是在炎症趋化因子的作用下最早到达炎症部位的免疫细胞。研究显示，中性粒细胞可以透过血脑屏障(blood brain barrier，BBB)到达脑肿瘤部位。Xue等[13]研究发现，携载含有紫杉醇(paclitaxel)脂质体的中性粒细胞可以有效抑制小鼠脑胶质瘤的术后复发。脑胶质瘤切除后释放的大量炎症因子会诱导中性粒细胞向大脑炎症部位聚集，同时术后炎症部位高浓度的炎症信号会促使紫杉醇从中性粒细胞中释放，进一步作用于术后残留的肿瘤细胞。在手术治疗的胶质瘤小鼠模型中，载药中性粒细胞处理组术后4个月的存活率为25%，虽未能完全抑制肿瘤的再生，但可以有效缓解肿瘤的复发。

1.2.3 T淋巴细胞 T淋巴细胞来源于胸腺，是一种分型复杂的免疫细胞。T淋巴细胞在体内会向次级淋巴器官和炎症组织靶向聚集，已被广泛研究用于癌症治疗的细胞疗法。在早期的临床试验中，注入修饰的T细胞对癌症和慢性炎症的治疗都有较好的效果。T细胞不仅可以直接靶向杀伤肿瘤细胞，同时还可以作为药物载体，起到双重抗肿瘤的效果。Stephan等[14]将携载化疗药物的纳米粒连接在T细胞表面，注入小鼠皮下移植瘤模型中。 给药10 d后，相比于空白对照组，载药T细胞处理组的肿瘤体积缩小为原来的19.23%(P<0.001)，而在未经修饰的T细胞处理组中，肿瘤大小仅缩小为原来的83.33%，携载的化疗药物明显增强了T细胞的抗肿瘤效果。

1.3 干细胞 成体干细胞是组织特异性细胞，原则上它只能分化为一系列特定的组织细胞。与胚胎干细胞相比，成体干细胞移植后引起肿瘤的可能性较低，可用于组织再生治疗，在临床研究中引起了较大的关注。同时成体干细胞向炎症部位和肿瘤组织靶向富集的特点，使其成为癌症治疗中理想的传递载体[15]。有研究显示，成体干细胞可有效地将免疫调节剂、溶瘤病毒和包载化疗药物的纳米粒运输至肿瘤部位，明显提高了这些治疗制剂的靶向性。Ho等[16]将加载喜树碱的纳米液滴导入至脂肪来源的成体干细胞中，载药后干细胞的存活率为(77±4)%，载药纳米液滴被干细胞运输至肿瘤部位后，在超声波刺激下释放药物并形成气泡，以形成超声造影成像。目前，作为传递载体研究最多的是来自骨髓的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)，和来自大脑特定神经区域的神经干细胞(neural stem cells, NSCs)。与免疫细胞相似，MSCs的表面表达大量的黏附因子[17]，静脉注射后可从血管渗出进入各组织。目前MSCs被用作多种肿瘤治疗的传递载体，如神经胶质瘤[18]。但有研究表明，MSCs的免疫抑制作用可能会促进原发性和转移性肿瘤的生长[19]，从而限制了其在特定临床环境中的应用。NSCs是一种非致瘤性和低免疫原性的成体干细胞，对多种类型的肿瘤都显示出明显的趋向作用。NSCs可作为基因载体，将治疗基因通过病毒基因重组的方式转导到NSCs中，用以治疗癌症相关性疾病。NSCs来源于大脑，需要通过侵入性手术的方法来获取这些细胞，复杂的提取手段限制了细胞来源和临床应用的可能性。但有报道显示，自体神经干细胞可以从骨髓中获取，这为NSCs的临床应用带来了希望[20]。

1.4 肿瘤细胞 近年来有研究发现，肿瘤细胞表面表达着大量的表面黏附因子(半乳糖凝集素3)，肿瘤细胞膜表面的癌胚抗原与同源肿瘤细胞间黏附因子的相互作用，会造成细胞间的黏附聚集。基于肿瘤细胞的这一特性，将肿瘤细胞膜包裹在含药纳米载体的表面，利用肿瘤细胞膜表面的黏附分子靶向识别同源癌细胞，可实现同源肿瘤的定向给药[21]。Sun等[22]设计了一种以携载DOX的金纳米粒(AuNs)为内核，4T1乳腺癌细胞膜为外壳的仿生纳米递药系统。这种递药系统结合了肿瘤细胞的同源靶向性和金纳米粒的光热效应，静脉注射入小鼠体内后会在肿瘤部位靶向聚集，在外部近红外光的照射下产生热量，促使药物在肿瘤部位有效释放。这种光热疗法和化学疗法的联合应用可以有效地杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。也可以用肿瘤细胞膜包载一些功能性纳米粒，将其运输至肿瘤部位，实现对体内肿瘤的诊断和检测。Chen等[23]用肿瘤细胞膜包裹携载吲哚菁绿(indocyanine green)的纳米粒，通过荧光/光声双模态成像，可以对体内肿瘤的动态分布进行实时监测。监测结果表明，包裹肿瘤细胞膜的纳米粒可以有效地向同源癌细胞靶向聚集，同时能减少肝脏和肾脏的摄取，具有良好的免疫逃避能力。

2 细胞载药方式

细胞携载药物或纳米载体的方式主要包括细胞内吞，以及通过非共价键或共价键在细胞表面连接纳米载体。

2.1 细胞内吞 将细胞与药物共同孵育，通过细胞的内吞将药物载入细胞内是一种简单高效的载药方式。在上述介绍的载药细胞中，免疫细胞具有最强的吞噬能力，能通过内吞作用吞噬纳米药物形成细胞-纳米药物递送系统。Tao等[24]研究显示，将巨噬细胞与载有紫杉醇的纳米载体共同孵育，当紫杉醇的浓度达到100 μmol/L 时，8 h后几乎所有的载药纳米粒均被细胞摄取。在生理条件下，通过该方法制备的载药巨噬细胞在4 d内能将80%的紫杉醇排出细胞。为了进一步提高载药细胞对纳米载体的有效摄取，可以在纳米载体的表面修饰靶向配体。Qin等[25]将RGD肽(Arg-Gly-Asp)连接到脂质体表面，RGD作为靶向配体可与中性粒细胞和单核细胞表面的整联蛋白受体相结合，促进细胞对脂质体的内吞作用。经过RGD 修饰后，单核细胞对脂质体的摄取效率由41.72%提高至64.89%。并且有研究显示，随着纳米载体表面修饰配体密度的增加，细胞对纳米载体的摄取效率也有所提高[26]。内吞的方法装载药物虽然简单高效，但也存在以下一些缺点：(1)装载的药物或纳米载体可能会影响细胞的活性，对细胞的肿瘤靶向性和迁移能力产生影响。(2)细胞内吞可能会导致纳米载体的降解，从而影响疗效[27]。为解决以上问题，可将纳米载体通过共价键或非共价键的方式连接在细胞表面，随着细胞转运至炎症和肿瘤部位。

2.2 非共价偶联 非共价偶联的过程中只需简单混合，纳米载体便可通过氢键、范德华力或静电力等形式附着在细胞表面。纳米载体的尺寸以及纳米载体/细胞的比例是影响细胞携载纳米载体数目的两个最重要的因素。提高纳米载体/细胞间的比例可以使细胞表面附着更多的纳米粒，但过量的纳米载体会导致细胞间的相互凝集。纳米载体的尺寸对细胞表面附着的纳米载体数目也有着较大影响。Anselmo等[28]采用非共价偶联的方式将PLGA纳米胶束连接在红细胞表面，提高了纳米胶束的血液循环时间，减少了肝脏和脾脏的摄取。这种连接方式不会影响红细胞的功能，也不会发生溶血现象。但非共价偶联是一种脆弱的连接方式，静脉给药后，在血流剪切应力和细胞间的相互作用下，纳米载体容易从细胞表面解离。因此，须采用共价偶联的方式增加纳米载体与细胞之间的黏合强度。

2.3 共价偶联 研究发现，许多细胞表面存在着大量的功能基团(如氨基、巯基和唾液酸残基等)。因此可以对合成的纳米载体进行化学修饰，以共价偶联的方式连接到细胞表面。共价偶联是一种相对稳定的连接方式，可以有效防止载体在体内循环的过程中从细胞表面解离。Stephan等[29]将脂质体纳米粒用马来酰亚胺修饰后，与T细胞表面的巯基通过共价偶联的方式结合。通过该方法可将大量直径在100～300 nm的纳米载体连接在T细胞表面。与未经修饰的T细胞相比，经共价键连接纳米载体的T细胞其迁移能力未发生明显改变。穿越内皮屏障后，约有83%的纳米载体保留在T细胞表面。然而这种稳定的共价偶联使得纳米载体在到达治疗部位后难以从细胞表面解离。因此，在今后的研究中，有必要开发设计一种能在体内循环过程中保持稳定，经环境刺激后有效释放载体的细胞给药系统。

3 展 望

细胞载体具有良好的生物相容性及靶向能力，是一种极具应用前景和临床发展潜力的给药系统。但这类给药系统仍处于发展初期，还存在一些问题有待解决。(1)细胞经修饰和载药后其生物活性和趋向性可能会受到影响[30]。(2)细胞载体的体内安全性评价仍然有待探索。目前大多数关于细胞载体的研究仅在体外进行，动物实验和人体试验相对较少，其安全性尚未满足临床应用的要求。(3)细胞载体源于生物体，其提取制备过程复杂，目前难以实现大规模产业化制备。随着研究的深入，今后会有更多类型的细胞应用于细胞载药系统，其安全性也会进一步提高。相信细胞介导的药物递送系统会为药物的靶向递送及精准治疗提供一种新思路。