人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA及p16/Ki-67蛋白共表达在不同级别宫颈病变中的临床意义*

郭珍，赵冬梅，贾漫漫，郭沛沛，吴泽妮，陈佩佩，孙星媛，张韶凯

450008 郑州，郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院 中心实验室(郭珍)，病理科(赵冬梅)，妇瘤科(贾漫漫)，癌症中心办公室(陈佩佩、孙星媛、张韶凯);450014郑州，郑州大学第二附属医院 生殖医学科(郭沛沛);100021 北京，国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院 流行病室(吴泽妮)

子宫颈癌发病率在全世界女性恶性肿瘤中居第四位。全世界每年大约有53万宫颈癌新发病例，27.5万死亡病例，其中约85%的病例发生在卫生资源有限的发展中国家[1]。目前世界上公认，高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持续感染是子宫颈癌发生发展的主要危险因素[2-4]，这使得高危型HPV检测成为一种有效的子宫颈癌筛查技术。然而，用于人群早期筛查的HPV DNA 检测无法分辨一过性感染和可引起子宫颈病变的持续性感染，导致其特异度和阳性预测值较低，故用于预测子宫颈癌前病变转归能力不理想。因此，寻找更加客观准确的筛查标志物，以提高对子宫颈癌前病变的预测效果，减少不必要的转诊和过度治疗，已成为目前子宫颈癌筛查亟待解决的关键问题。在子宫颈癌进展过程中，常伴随一些分子水平的变化，通过对分子标志物的检测，可以在癌变进程早期阶段起到预警作用。其中，HPV 致癌基因E6/E7 mRNA反映了病毒的致癌活性，而p16/Ki-67蛋白在细胞周期调控中发挥重要作用。HPV E6/E7 mRNA和p16/Ki-67蛋白能分别从基因和蛋白两个层面反映疾病的进展状况，在子宫颈癌的早期筛查方面具有应用前景。本研究对HPV E6/E7 mRNA和p16/Ki-67蛋白在不同级别宫颈病变中的阳性率情况进行分析，为子宫颈癌的早期诊断和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择郑州大学第二附属医院妇科就诊的20～79岁妇女作为研究对象，对符合入选标准的研究对象采集标本进行相关检测。入选标准：(1)年龄在20～79周岁的妇女；(2)签署知情同意书，同意采集用于本研究的宫颈上皮脱落细胞和宫颈组织；(3)没有临床怀孕的可疑症状，孕妇在妊娠结束后8周可参加研究；(4)无宫颈外科手术史(如子宫切除术)。排除标准：不符合上述任何入选条件之一者。该研究已获得河南省肿瘤医院伦理委员会的批准(编号：2016007)。所有参与研究的妇女均已签署知情同意书。

1.2 问卷调查

由经统一培训的调查员对同意入组的妇女进行一对一问卷调查，首先询问婚姻状况、宫颈癌病史、宫颈手术史等以判断是否纳入或排除该女性，其次询问包括教育程度、吸烟饮酒史、月经史、生育史等一般情况。

1.3 妇科检查及标本收集

由妇科医生对符合入选标准的妇女进行妇科检查，并采用扫帚样刷子收集子宫颈脱落细胞标本，置于转移介质PreservCyt®液体(美国Hologic公司)中，待后续相关实验检测。同时,由有经验的阴道镜医生对其进行阴道镜检查，如果为阴道镜暴露充分且存在病变部位则异常处取活检，若阴道镜暴露不充分则进行宫颈搔刮术(endocervical curettage,ECC)。

1.4 实验室检测

以下所有检测和诊断过程均严格遵守盲法原则。

1.4.1 液基细胞学检测(LBC，ThinPrep; Hologic-Cytye,Marlborough,Mass) 将采集到宫颈脱落细胞标本制片染色后按照Bethesda 分类系统进行阅片诊断。分类包括：无上皮内病变或恶性病变(negative for intraepithelial lesion or malignancy,NILM)、意义不明的不典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASC-US)、非典型鳞状细胞，不除外高级别鳞状上皮内病变(atypical squamous cell,cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H)、不典型腺细胞(Atypical glandular cells,AGC)、低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)、鳞癌(squamous cell carcinoma,SCC)、原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)和腺癌(adenocarcinoma,ADC)[5]。LBC结果判断为NILM时定义为正常。

1.4.2 HPV E6/E7mRNA检测 HPV E6/E7 mRNA采用APTIMA HPV实验进行检测，该实验主要包括mRNA的提取、扩增及扩增产物检测三个步骤。提取出的mRNA通过TMA法进行扩增，该方法是利用MMLV反转录酶和T7核糖核酸聚合酶而进行的以反转录为基础的核酸扩增方法。MMLV反转录酶可催化含有T7核糖核酸聚合酶启动子序列的mRNA反转录为cDNA，进而在T7核糖核酸聚合酶作用下，反转录的cDNA为模板进一步合成DNA而完成mRNA的扩增。扩增后的产物通过HPA法进行检测，该方法利用荧光探针特异性与扩增产物杂交，选择剂淬灭未杂交探针上的荧光以区分杂交和未杂交探针，然后光度计测量杂交混合物上的荧光光量子，最终通过分析物的信号与截点比值(S/CO)来进行结果判定。

1.4.3 p16/Ki-67双蛋白共表达检测 采用德国mtm实验室研发的一项名为CINtec PLUS的新技术，利用免疫细胞化学双染法的原理进行检测，细胞学医师在显微镜下阅片，若视野中出现至少1个宫颈细胞的细胞质呈红色(p16)，细胞核呈黄色或棕色(Ki-67)则判读为阳性；其他为阴性[6]。

1.4.4 病理诊断 阴道镜下所取的活检或ECC标本移送至郑州大学第二附属医院病理科制片并进行病理诊断，报告采用宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)分级报告系统。同时，由郑州大学附属肿瘤医院有经验的病理医师对诊断结果进行复核，若复核结果与初始判读结果不一致，标本将送至中国医学科学院肿瘤医院进行最终判读。

1.5 统计分析方法

2 结 果

2.1 细胞学与组织病理学诊断结果

共收集研究对象537例，其平均年龄为43.88±10.97岁。细胞学诊断结果显示：183人(34.7%)细胞学结果正常，135人(25.1%)被诊断为ASC-US，22人(4.1%)被诊断为ASC-H，7人(1.3%)被诊断为AGC，82(15.3%)人被诊断为LSIL，75人(14.0%)被诊断为HSIL，31人(5.8%)被诊断为SCC，2人(0.4%)被诊断为AIS。组织病理学诊断结果显示：298人(55.5%)病理学结果正常，30人(5.6%)被诊断为CIN1，48人(8.9%)被诊断为CIN2，111人(20.7%)被诊断为CIN3，43人(8.0%)被诊断为宫颈鳞癌，7人(1.3%)被诊断为宫颈腺癌。详见表1。

表1 537例研究对象液基细胞学和组织病理学诊断结果

Table 1. Diagnostic Results of Liquid-based Cytology and Histopathology in 537 Patients

LBCCase (n)Percent(%)Histopa-thologyCase (n)Percent(%)Normal18334.7Normal29855.5ASC-US13525.1CIN1305.6ASC-H224.1CIN2488.9AGC71.3CIN311120.7LSIL8215.3SCC438.0HSIL7514.0ADC71.3SCC315.8---AIS20.4---

ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance；ASC-H: atypical squamous cell, cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion; AGC: atypical glandular cells; LSIL: low-grade squamous intraepithelial lesion; HSIL: squamous intraepithelial lesion; SCC: squamous cell carcinoma; AIS: adenocarcinoma in situ; CIN: cervical intraepithelial neoplasia; ADC: adenocarcinoma.

2.2 不同病理级别人群中HPV mRNA与p16/Ki-67阳性检出情况比较

HPV mRNA和p16/Ki-67阳性率均随着病理级别的增加而增加(P<0.001)。HPV mRNA在病理正常人群中的阳性率为19.1%，在宫颈鳞癌中的阳性率为100%。p16/Ki-67在病理正常人群中的阳性率为13.1%，在宫颈鳞癌中的阳性率为97.7%。详见表2。

2.3 不同细胞学诊断结果中HPV mRNA与p16/Ki-67阳性检出情况比较

与在不同病理级别中的阳性率趋势基本一致，HPV mRNA与p16/Ki-67的阳性率随着细胞学结果的严重程度增加而增加(P<0.001)。HPV mRNA在细胞学正常人群中的阳性率为18.6%，在宫颈SCC中的阳性率为100%。p16/Ki-67在细胞学正常人群中的阳性率为14.2%，在宫颈SCC中的阳性率为93.5%。详见表3。

表2 不同病理级别人群中HPV mRNA和p16/Ki-67的阳性率

Table 2. Positive Rates of HPV mRNA and p16/ ki-67 in Different Pathological Groups

Pathological resultmRNANegativePositive Positive Rate (%)p16/Ki-67NegativePositive Positive Rate (%)Normal2415719.12593913.1CIN1181240.0201033.3CIN264287.5103879.2CIN3610594.6129989.2SCC043100.014297.7ADC1685.71685.7χ2276.6288.8P<0.001<0.001

CIN: cervical intraepithelial neoplasia; SCC: squamous cell carcinoma; ADC: adenocarcinoma.

表3 不同液基细胞学诊断结果中HPV mRNA 和p16/Ki-67的阳性率

Table 3. Positive Rates of HPV mRNA and p16/ ki-67 in Diagnostic Results of LBC

LBCmRNA NegativePositive Positive Rate (%)p16/Ki-67NegativePositive Positive Rate (%)Normal1493418.61572614.2ASC-US914432.61003525.9ASC-H41881.851777.3AGC3457.11685.7LSIL235972.0315162.2HSIL27397.376890.7SCC031100.022993.5AIS02100.002100χ2213.646209.794P<0.001<0.001

ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance；ASC-H: atypical squamous cell, cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion; AGC: atypical glandular cells; LSIL: low-grade squamous intraepithelial lesion; HSIL: squamous intraepithelial lesion; SCC: squamous cell carcinoma; AIS: adenocarcinoma in situ.

3 讨 论

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，宫颈HPV持续感染是导致宫颈癌前病变及向宫颈癌发生、发展的关键因素[7]，但研究表明，HPV DNA阳性者中有绝大多数是HPV一过性感染，约70%～80%的女性在一生中有可能感染HPV，其中有90%的感染者可在8～24个月内自然清除，只有高危型HPV的持续性感染才有可能导致宫颈病变或宫颈癌[8-10]，这使得HPV DNA检测虽然具有较高敏感度，但是特异度相对较低[11]。因此，寻找更有效的宫颈筛查方法迫在眉睫。

高危型HPV感染宫颈细胞后，通过非同源重组的方式将其DNA整合到宿主细胞基因组后，大量转录两个致癌基因E6、E7的mRNA，导致HPV E6/E7癌蛋白高表达[12-13]。E6、E7癌蛋白分别通过与p53蛋白和pRb蛋白结合，使肿瘤抑制基因p53与pRb失活，损伤细胞DNA，激活端粒酶活性，引起细胞过度增殖，触发细胞永生化及恶性转化，最终导致肿瘤发生[14-17]。因此，将HPV E6/E7基因产物作为子宫颈癌筛查的分子标志物比HPV DNA更具特异性。本研究采用2012年美国美国食品药品管理局(FDA)批准的一项HPV E6/E7 mRNA 检测技术(APTIMA HPV)，同时检测14种高危型别HPV E6/E7 mRNA。结果显示，HPV E6/E7 mRNA阳性率随着宫颈组织病理学和细胞学分级的增高而增加(P<0.001)，提示，HPV E6/E7 mRNA阳性率与宫颈病变严重程度密切相关，HPV E6/E7 mRNA高表达，可能促进宫颈病变的发生和发展。这与Duvlis、Ratnam等人的研究结果一致[18-19]。

子宫颈癌进展过程中，细胞周期相关蛋白可以从另一个侧面反映其与子宫颈病变的关系。其中，p16蛋白是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，可阻止细胞从 G1期进入S期，并在持续性HPV感染中过度表达，引起细胞周期调控失常[20]。Ki-67是一种细胞核抗原和增殖标志物，在细胞周期的G1、S、G2、M期均有表达，在 G0期缺失[21]。2014年世界卫生组织推荐,对于诊断有争议的CIN2，可以采用p16免疫组化染色，p16阳性的CIN2按照CIN3处理，p16阴性的CIN2按照CIN1处理。Ki-67免疫组化染色在CIN2的分流中也具有重要的意义。正常情况下，同一细胞内p16和Ki-67不能同时表达，而当细胞周期调控失常时，特定细胞内则可同时表达p16和Ki-67。因此，可以将同时表达p16INK4a和Ki-67(简称p16/Ki-67)的宫颈上皮细胞作为细胞转化状态的一个指标。本研究采用CINtec PLUS新技术检测p16/Ki-67双蛋白共表达，结果显示，p16/Ki-67阳性率随着宫颈组织病理学和细胞学分级水平的升高而呈正相关(P<0.001)，这与相关研究的结果一致[22-24]。由此可认为，p16/Ki-67共表达阳性与宫颈病变程度密切相关，p16/Ki-67双染检测可用于指导 CIN的分级，该方法能够区分出真正向宫颈癌进展的病变，有效降低阴道镜的转诊率。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA 和p16/Ki-67表达与宫颈病变程度密切相关，HPV感染宫颈后的活化情况，可以通过检测 E6/E7 mRNA 和p16/Ki-67的表达情况来反映，对宫颈病变有一定的诊断效能。同时，p16/Ki-67双重染色操作简单，结果容易判读，技术人员经过短期培训后即可独立进行，故有望成为宫颈癌筛查及宫颈病变随访的检测方法。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测；

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。