miRNA-125a靶向调控SMURF1对结肠癌生物学行为的影响

邢旻琰，何美文，余佳泽，张超

0 引言

结肠癌早期特异性症状不明显，而术后复发和转移影响了治疗效果。当前，阐明结肠癌发生发展的分子机制对寻找新的分子靶点具有重要意义。miRNA是一类非编码小分子RNA。通过与靶基因mRNA 3’-UTR完全或不完全互补配对结合，导致靶miRNA降解或翻译抑制来调控靶基因的表达。研究证实，在结肠癌细胞中存在多个miRNA表达异常，且与结肠癌患者的分化程度、远处转移等病理特征之间存在相关性，提示miRNA可能参与结肠癌的发生及发展[1-2]。SMURF1是HECT型E3泛素连接酶，参与多个生物学信号通路，近来研究发现，其在结肠癌组织中呈现高表达，并协同泛素蛋白酶系统降解抑癌蛋白，表现出促癌功能[3]。miRNA-125a在多种肿瘤的形成和转移中发挥重要作用[4]。本研究旨在分析miRNA-125a与结肠癌相关临床指标的相关性，并探寻其通过靶向调控SMURF1在结肠癌的病理过程中所发挥的作用，为结肠癌的诊断及治疗寻找新靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2017年6月至2018年1月在我院收治的50例结肠癌患者，其中男21例、女29例，平均年龄（59.72±5.36）岁。所有患者无化疗或放疗史。

1.2 外周血采集

纳入研究的结肠癌患者均于清晨空腹状况下进行外周静脉血抽取，具体操作如下：采用一次性血清分离胶管，抽取外周静脉血约3 ml；待血清析出后以1 000g离心10 min，取上层血清保存至-80℃冰箱待检测。

1.3 qRT-PCR检测外周血miRNA-125a和SMURF1的表达

取0.5 ml血清标本，采用TRIzol法提取血清总RNA，实验步骤按照TRIzol试剂盒说明书进行。将提取到的总RNA按照反转录试剂盒说明书进行RNA反转录，合成cDNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应。miRNA-125a的测序PCR引物为：上游5’-TGTGTCTCTTTCACAGTGGATC-3’和下游5’-CCATCG TGTGGGTCTCAAG-3’。

1.4 SW480细胞培养

使用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基在37℃、5%CO2饱和湿度培养条件下培养SW480细胞。

1.5 细胞转染

根据转染SW480细胞的转染物进行分组：miR-NC组（转染negative control miRNA mimics），miRNA-125a模拟物转染组（转染miRNA-125a模拟物），miRNA-125a模拟物+SMURF1转染组（转染miRNA-125a模拟物和SMURF1）。

1.6 荧光素酶报告基因法检测miRNA-125a与靶基因SMURF1的结合

利用microRNA靶基因数据库预测miRNA-125a与SMURF1可能的作用位点。构建SMURF1野生型3’-UTR荧光素酶质粒pMIR-WT和突变型质粒pMIR-Mut：根据GenBank中登录的human SMURF1基因序列，上游：5’-ACTCCTGGTACA GCGACTCCGAAATCCT-3’，下游：5’-GTCCCT GCACTGTTGTCCTTTGCTCATA-3’，采用Primer Premier5.0软件设计PCR引物，PCR扩增目的基因片段，并连接入野生型载体，转化及菌液PCR鉴定，送南京金斯瑞科技有限公司测序，测序鉴定正确的重组载体命名为pMIR-WT。突变载体的构建步骤与双荧光素酶载体的构建基本一致 ，利用PCR突变法在野生型载体基础上设计突变引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以野生型载体为模板进行扩增，鉴定正确的重组载体命名为pMIR-Mut。将pMIR-WT、pMIR-Mut与miR-125a模拟物和negative control miRNA mimics共转染进SW480细胞，荧光素酶检测实验检测各组荧光素酶活性。

1.7 Western blot检测SMURF1蛋白表达

将miRNA-125a模拟物和negative control miRNA mimics分别转染SW480细胞中，36 h后用IP裂解液收集细胞。按照Western blot操作流程检测SMURF1蛋白的表达水平。

1.8 HE染色

将肿瘤组织经固定液固定，石蜡包埋，3～4 μm厚切片，45℃恒温箱中烘干后进行HE染色。

1.9 CCK-8检测细胞增殖

参照CCK-8试剂盒说明书步骤进行，各组转染24 h后，接种于96孔培养板，每孔加10 μl CCK-8，37℃培养2 h，酶标仪上480 nm波长处测定A值。

1.10 细胞划痕实验检测细胞迁移

各组转染48 h后，细胞经胰酶消化吹打为单细胞悬液，接种于12孔细胞培养板，恒温培养24 h。待细胞长成单层（铺满培养板底部）弃去培养液，在每孔中央划出一个划痕，洗去死亡细胞，显微镜下拍照。利用软件测量并计算24 h细胞迁移距离。

1.11 流式细胞法检测细胞周期

悬浮并收集不同时间点细胞，0.9%氯化钠溶液冲洗细胞两遍，70%乙醇固定。加入碘化丙啶DNA荧光染色（PI:50 mg/L, 1% Triton X-100），4℃冰箱避光染色30 min，铜网过滤，取合格的单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞周期。

1.12 构建结肠癌肿瘤异种移植小鼠模型

取分别转染miRNA-125a模拟物和negative control miRNA mimics的结肠癌SW480细胞，调整细胞密度至2×108个/毫升。取0.1 ml细胞悬液注射于每只裸鼠左前肢腋窝皮下，将裸鼠随机分为两组，分别注射转染了miRNA-125a模拟物和转染了negative control miRNA mimics的SW480细胞。每日观察裸鼠皮下肿瘤生长情况，21天后将肿瘤从裸鼠身上分离，PCNA染色分析细胞增殖情况。

1.13 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料用（±s）表示，两组样本均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-125a在结肠癌和癌旁正常组织的表达

qRT-PCR结果显示，相比癌旁正常组织，结肠癌组织中miRNA-125a的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1A。同时，miRNA-125a在发生远端转移肿瘤组织中的表达水平显著低于未转移肿瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1B。提示miRNA-125a可能与结肠癌的发生及发展有关。

图1 miRNA-125a在结肠癌和癌旁正常组织中的表达Figure1 miRNA-125a expression in colon cancer and adjacent normal tissues

2.2 miRNA-125a与结肠癌患者临床指标的相关性

分析结果表明，miRNA-125a的表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远端转移、肿瘤浸润深度和肿瘤直径相关（均P＜0.01），与性别和年龄无关，见表1。

表1 miRNA-125a与结肠癌患者临床指标的关系Table1 Relationship between miRNA-125a and clinical indicators of patients with colon cancer

2.3 miRNA-125a通过结合SMURF1的3'-UTR来抑制SMURF1的表达

根据microRNA靶基因数据库预测潜在的miRNA-125a靶基因为SMURF1，见图2A。将miRNA-125a模拟物、negative control miRNA mimics（miR-NC）以及构建的pMIR-WT和pMIR-Mut质粒转染入SW480细胞，36 h后检测荧光素酶活性。结果显示，相比miR-NC组，miRNA-125a模拟物转染组pMIR-WT质粒荧光素酶活性显著降低（P＜0.01），而pMIR-Mut质粒荧光素酶活性无明显变化，见图2B。结果显示miRNA-125a可以通过结合SMURF1的3’-UTR进而抑制SMURF1的表达。

图2 miRNA-125a结合SMURF1的3’-UTR抑制荧光素酶活性Figure2 miRNA-125a binded 3'-UTR of SMURF1 to inhibit luciferase activity

2.4 miRNA-125a抑制SMURF1 mRNA翻译及蛋白水平

qRT-PCR检测结果显示miRNA-125a模拟物转染组中SMURF1 mRNA表达水平明显低于miRNC组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3A。Western blot检测结果显示，相比miR-NC组，miRNA-125a模拟物转染组中SMURF1蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3B。

图3 miRNA-125a抑制SMURF1 mRNA和蛋白表达Figure3 miRNA-125a inhibited mRNA and protein expression of SMURF1

2.5 SMURF1与结肠癌患者临床指标的相关性

统计分析发现，SMURF1的表达水平与肿瘤分化程度、淋巴转移、远端转移、肿瘤浸润深度和肿瘤直径呈正相关（P＜0.01），与性别和年龄无关，见表2。

表2 SMURF1与结肠癌患者临床指标的关系Table2 Relationship between SMURF1 and clinical indicators of patients with colon cancer

2.6 SMURF1在结肠癌组织中的表达

HE染色结果显示，相比癌旁正常组织，结肠癌组织中SMURF1表达水平明显升高，见图4A。而结肠癌患者血清中miRNA-125a表达水平与SMURF1表达水平呈负相关性，见图4B。

2.7 miRNA-125a和SMURF1与细胞增殖、迁移及周期的相关性

CCK-8检测结果显示，miRNA-125a模拟物转染组A值明显低于miR-NC组，差异有统计学意义（P=0.029）。而miRNA-125a模拟物+SMURF1转染组A值明显高于miRNA-125a模拟物转染组，差异有统计学意义（P=0.006），见图5A。流式细胞术检测结果显示，miRNA-125a模拟物转染组的S期细胞比值明显低于miR-NC组，差异有统计学意义（P=0.048），而miRNA-125a模拟物+SMURF1转染组的S期细胞比值明显高于miRNA-125a模拟物转染组，差异有统计学意义（P=0.004），见图5B。细胞划痕实验检测结果显示，miRNA-125a模拟物转染组的细胞迁移距离明显低于miR-NC组，差异有统计学意义（P=0.031），而miRNA-125a模拟物+SMURF1转染组的细胞迁移距离明显高于miRNA-125a模拟物转染组，差异有统计学意义（P=0.002），见图5C。

2.8 miRNA-125a抑制小鼠体内肿瘤生长

采用SW480细胞构建结肠癌肿瘤异种移植小鼠模型，将negative control miRNA mimics（miRNC），miRNA-125a模拟物转染SW480细胞并注射到裸鼠皮下21 d后，切除肿瘤并称重，miRNA-125a模拟物转染组肿瘤重量明显低于miR-NC对照组，差异有统计学意义（P=0.003），见图6A。PCNA染色结果显示, 相比miR-NC对照组，miRNA-125a模拟物转染组的SW480细胞中SMURF1阳性信号明显减少，且细胞增殖明显降低，见图6B。

图4 SMURF1在肿瘤组织中的表达Figure4 Expression of SMURF1 in colon cancer tissues

图5 miRNA-125a和SMURF1对细胞增殖、迁移及周期的影响Figure5 Effects of miRNA-125a and SMURF1 on cell proliferation, migration and cell cycle of colon cancer

图6 miRNA-125a抑制小鼠体内肿瘤生长Figure6 miRNA-125a inhibited tumor growth in mice

3 讨论

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，具有疾病隐匿、症状不典型且易转移的生物学行为特征。目前虽然大量研究证实TGF-β/Smad[5]、RhoA[6]、PI3K/AKT[7]、Wnt[8]等信号通路的异常活化或失活与结肠癌的转移密切相关，但对结肠癌的临床治疗仍未有较为突出的贡献。因此，从新的生物学层面挖掘其发展机制具有重要意义。miRNA是一类长度为22～28个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，与许多恶性肿瘤的发生发展存在密切关系，它参与调控细胞凋亡、增殖、侵袭和转移相关的生物学事件，起着癌基因或抑癌基因的作用。有报道证实miR-143、miR-145及miR-101在结肠癌中低表达[9-10]，可能是潜在的抑癌因子。miR-106a、miR-181b、miR-203[11-13]等在结肠癌组织中高表达，提示miRNA在结肠癌的发生及发展过程中发挥重要作用。

Lyu等[14]发现miRNA-125a可通过抑制ERBB2和ERBB3的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖和转移；miRNA-125a表达受EGFR调节，抑制肺癌细胞的转移；此外，miRNA-125a可以抑制ARID3B来负性调节卵巢癌EMT，从而抑制卵巢癌细胞的转移。然而，miRNA-125a在结肠癌中的作用尚未有相关报道。本研究发现miRNA-125a表达量随结肠癌发展程度的加深呈降低趋势，提示miRNA-125a与结肠癌的发生发展密切相关。

SMURF1属于HECT型E3泛素连接酶，参与TGF-β/Smad、Wnt、BMP、MAPK等多种生物学信号通路的调控。SMURF1高表达可以影响肿瘤组织的侵袭、转移，与肿瘤预后关系密切。研究发现SMURF1促进抑癌蛋白的快速降解，是促进结直肠癌发生发展的一个重要因子[15]。本研究检测到结肠癌患者肿瘤组织中miRNA-125a的表达水平显著降低，且结肠癌患者血清中SMURF1表达水平随结肠癌发展程度（肿瘤分化程度、淋巴转移、远端转移、肿瘤浸润深度和肿瘤直径）加深而呈升高趋势，而miRNA-125a表达水平与SMURF1表达水平呈负相关性。进一步HE染色发现，SMURF1在结肠癌组织中表达水平明显升高，提示SMURF1在结肠癌中发挥促癌作用，与以往研究结果相似[16]。本研究采用microRNA靶基因数据库预测获得SMURF1为miRNA-125a潜在靶基因，并验证了miRNA-125a可以通过结合SMURF1的3’-UTR进而抑制SMURF1的表达，同样miRNA-125a能够抑制SMURF1的mRNA翻译和SMURF1蛋白水平表达。这些结果提示miRNA-125a可能通过对SMURF1的靶向调控参与到结肠癌的病理过程中。本研究还发现miRNA-125a可通过抑制SMURF1的表达水平从而抑制结肠癌的发展。在本研究中，我们将miRNA-125a模拟物转染的SW480细胞注射到裸鼠皮下，观察到miRNA-125a能够抑制肿瘤生长及SMURF1的表达。这进一步验证了miRNA-125a对结肠癌发挥抑癌作用。

综上所述，mi RNA-125 a 通过结合靶基因SMURF1的3’-UTR，抑制结肠癌促癌因子SMURF1的表达，进而抑制癌细胞的增殖、迁移和S期细胞的聚集，在结肠癌的发展过程中发挥抑制作用。因此，miRNA-125a可能为结肠癌的诊断及治疗提供新的研究方向。