基于衍射重构技术的作物真菌病害孢子微型检测装置

杨 宁 陈驰原 李国晓 王爱英 张荣标 唐 健

(1.江苏大学电气信息工程学院， 镇江 212013； 2.中国水稻研究所稻作技术研究与发展中心， 杭州 311401)

0 引言

作物真菌病害因其传播速度快、危害大等特点给病害检测预警带来了巨大的挑战[1-2]。真菌病害是由散布在空气中的真菌孢子浸染水稻引起的[3-6]。因此，对空气中孢子浓度的测定是病害流行分析和预警中不可或缺的部分[7]。

作物真菌病害的检测方法归结起来主要有免疫检测法、核酸检测法、微悬臂梁检测法、分子生物学检测法、形态学鉴定法等。免疫检测法利用抗原和抗体特异性结合的原理，实现特定微生物浓度的快速检测，精度较高[8]。核酸检测法利用分子扩增技术，大大减少了检测时间，且灵敏度较高。上述方法需要特异性抗体或引物以及专业的人员及设备，实现野外即时检测的难度较大[9]。微悬臂梁检测法是一种将敏感材料或受体分子修饰在微悬臂梁表面，对待检目标气体或液体分子进行吸附，造成微悬臂梁运动状态改变来标定待检物浓度的方法[10]。如NUGAEVA等[11]使用镀金和未涂覆硅的微机械悬臂阵列，快速定量检测了黑曲霉和酿酒酵母浓度。该方法具有高精度与高灵敏度的特点，但是微悬臂梁检测法对检测环境要求严格，当环境中的杂质污染物被吸附时，将影响最终的检测结果，难以适应复杂的野外环境条件[12]。显微图像计数法由人工观察显微图像并计算孢子数量，检出限更低，检测精度较高，克服了上述检测方法的弊端，但检测时间长、人力消耗大、数字化程度低[13]。而目前利用图像形态学鉴定进行自动识别真菌孢子个数的相关技术也逐步出现，李小龙等[14]、齐龙等[15]利用形态学鉴定方法对捕捉的孢子实现准确计数，但该检测法主要依赖野外采样和实验室观测两个步骤，滞后性较大，不能实现对作物真菌病害的早期预警。

姜玉英等[16]、雷雨等[17]将自动对焦显微镜集成到孢子捕捉仪上实现捕捉数量的大概计数，MELO等[18]利用神经网络深度学习检测方法对孢子进行分类计数，这些方法依旧需要借助高倍显微镜等昂贵的仪器进行辅助检测，相较于显微图像计数法，提升了数字化水平，但是技术复杂，成本仍然较高，无法推广实施。国内托普云农研制的孢子捕捉仪处于国际领先地位，但它仍然是基于传统显微图像检测方法，使用气泵直接抽取空气到捕捉仪内的显微镜下，搭载图像采集卡的显微镜采集孢子图像，然后传输到上位机对孢子进行识别，整个系统体积巨大、成本高昂，不适合大面积农业推广与野外布置。

衍射技术多应用于血液检测[19]、藻类检测[20]和精子检测[21]等生物医学相关领域。LI等[22]根据惠更斯-菲涅尔衍射原理设计了基于衍射指纹的癌细胞活性检测系统，该系统体积较大，使用不便。因为细胞培养环境纯净，所以每个衍射环均表示细胞，而病害孢子在野外传播时，空气环境复杂，有的衍射环可能表示其他杂质，所以不宜直接分析衍射环，需要重构后再分析，以便于专家直接标记孢子和评判装置检测结果准确性。拍摄细胞衍射图像时，只需将细胞培养皿放置在系统内即可，而病害孢子在空气中传播，无法直接采样放置到系统内检测，所以需要富集装置。针对孢子检测的特点，本文将孢子的富集与衍射重构检测相结合，减小装置体积与质量，设计一种定时完成富集、进样、拍摄、重构和检测等系列功能于一体的装置。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用稻瘟病孢子作为研究对象，实验样本于2018年10月在中国水稻研究所采集。为了模拟稻瘟病孢子在空气中的传播状态，利用气溶胶发生器将稻瘟病孢子制成气溶胶粒子，均匀释放在体积为1 L的容器中。将气泵分别与容器和检测装置相连，这样容器中混有稻瘟病孢子的气体可被抽集至涂有凡士林的PDMS薄片上用于图像采集，空气中病害真菌孢子实际浓度C的计算公式为

(1)

式中N——一次实验中采集到的孢子个数

t——气泵工作时间,s

V——气泵流量，L/s

使用的微型气泵流量为0.02 L/s，开展10组采样实验，并在显微镜下观察每组采样的孢子数，最后由式(1)得出样本的平均浓度为100个/L，将此浓度视为标准单位浓度。为保证装置中用于采样的PDMS薄片可长期使用，只需将本次检测到的孢子数减去前一次检测到的孢子数即为本次实验采集到的孢子数，无需每次更换。

1.2 衍射重构技术理论

1.2.1衍射成像装置工作原理

传统光学显微镜成像技术是基于光穿过透明物质时发生波长(颜色)和振幅(亮度)变化来实现的，肉眼通过显微镜直接观察微生物等的形态。LED发出的光通过微孔转换成相干光，从而实现相干照明。如图1所示，LED光源发出的光经过其正下方的微孔后，产生部分相干光，部分相干光传播l1距离后照射到样本平面(PDMS薄片)上。样本平面上样本的支透光与样本的散射光互相干涉并被其正下方相距l2的CMOS成像芯片拍摄下来，图2为样本的衍射全息图。首先利用角谱理论对全息图进行相位信息恢复，并基于恢复后的孢子图像研究其形态学特征。

图1 装置成像原理示意图Fig.1 Diagram of equipment imaging principle 1.光源 2.微孔 3.部分相干光 4.样本平面 5.CMOS成像芯片

图2 衍射全息图像Fig.2 Hologram image

1.2.2角谱重构理论

在标量衍射的亥姆霍兹方程理论中，角谱理论从频域的角度准确描述了光的衍射过程，将部分相干光场看作不同方向传播的平面波分量，光传播方向上任意一点的复振幅均被表示出来[23]。

振幅为U，波长为λ，方向余弦为cosα、cosβ、cosγ的波矢传播的平面波复振幅为

(2)

U(x,y,z)=Uexp(2πi(xfx+yfy+zfz))

(3)

式中x、y——全息图像素坐标

z——再现距离

α、β、γ——平面参考光波与空间的yoz平面、xoz平面、xoy平面的夹角

根据角谱理论，由角谱重构法得到的原像光场U(xi,yi,zi)的复振幅分布为

U(xi,yi,zi)=F-1(F(R(x,y)I(x,y))GAS(fx,fy))

(4)

其中

(5)

其中

式中F、F-1——傅里叶变换和逆傅里叶变换

I(x,y)——全息图的强度分布

R(x,y)——参考光波振幅分布

GAS(fx，fy)——衍射在频域的传递函数

角谱重构过程如图3所示，其中图3a是装置采集的衍射全息图，图3b是计算机利用角谱法计算重构后得到的原像，可以看出孢子的轮廓被清晰地重构出来。

图3 孢子重构图像Fig.3 Spore reconstruction images

1.3 稻瘟病孢子再现像的目标识别

为了准确地识别出再现像中稻瘟病孢子，使用数字图像处理技术对图像进行滤波、阈值分割和特征提取等操作。

1.3.1中值滤波

图4a为角谱重构之后得到的再现像，其中椒盐噪声和脉冲噪声较多，针对该类图像，选择中值滤波进行降噪[24]。图4b是中值滤波后图像，选取3×3的窗口对重构图像进行滤波，在降低噪声的同时尽可能地减少了细节丢失。

图4 中值滤波Fig.4 Median filtering

1.3.2阈值分割

由图5a知，检测目标颜色与背景颜色相差较大，故可以采用阈值分割的方式将图像分为背景区域和目标区域。预备试验知孢子灰度主要分布在0～100之间，灰度较高部分均为背景。故本文采用枚举法确定阈值，枚举区间为0～100，步长为0.5，阈值分割流程如图6所示，每次阈值加0.5，当阈值为76.5时，轮廓最为明显，分割结果如图5b所示。

图5 阈值分割Fig.5 Threshold segmentation

图6 阈值分割流程图Fig.6 Flow chart of threshold segmentation

图8 图像采集与光源模块结构Fig.8 Image acquisition and light source module 1.LED光源 2.微孔 3.部分相干光 4.样本 5.PDMS薄片 6.CMOS模块

1.3.3基于形状特征的识别与计数算法

稻瘟病孢子具有独特的形态特征(细长的梨形)和较为固定的尺寸范围(长(15±5)μm，宽(7±2)μm)。因此，可以对重构后的稻瘟病孢子选择面积(Area)、细度(Thinness ratio)两个形态学参数进行稻瘟病孢子的识别和计数。其中面积A定义为目标区域所包含的像素数量，用于描述区域面积。细度T用于描述目标形状的纤细程度，定义为

(6)

式中P——稻瘟病孢子的周长

测定50组共500个稻瘟病孢子重建后图像的面积A和细度T，其中一组数据如图7所示，矩形方框内为稻瘟病孢子。故将同时满足A为10～30，且T为0.9～1.4的目标判定为稻瘟病孢子。

图7 面积-细度特征二维图Fig.7 Two-dimensional chart of area-thinness characteristic

1.4 真菌病害微型检测装置设计

1.4.1图像采集与光源模块设计

利用CMOS图像传感器采集衍射全息图，结果如图8a所示。选择Aptina公司500万像素的MT9P031型图像传感芯片，成像区域尺寸为5.70 mm×4.28 mm。由于LED光源是单色光，故定制了该芯片的黑白版来直接获得灰度图像，以提升图像的信噪比。

光源模块(图8b)长度为4 cm(对应图1的l1)，其内部光路和部件位置如图8c所示，微孔直径设定为100 μm，选择OSRAM公司的LA E65B型(LED波长617 nm)，两部件位于光源模块正上方，从上往下发出部分相干光覆盖CMOS模块的感光区域；订制的PDMS薄片厚度为1 mm(对应图1的l2)，此设计可以简化光学设计，无需使用其他聚焦或校准透镜就可以照亮CMOS图像传感器的全部视场[25]。

1.4.2真菌病害微型检测装置设计

检测装置如图9所示，采用锂电池供电。实验时，计算机通过WiFi与图像采集模块通讯，并分析处理图像数据。为了满足气传孢子富集进样和装置内部避光的要求，设计了如图10所示的迂回式气路结构。气体从装置上方入口进入，沿着气道从装置两侧排出。

图9 真菌病害微型检测装置示意图Fig.9 Sketch of micro detection device for fungal disease 1.光源 2.PDMS薄片 3.气泵 4.导管 5.孢子 6.出气口 7.CMOS模块

图10 真菌病害微型检测装置气路结构示意图Fig.10 Pneumatic schematic of miniature detection device for fungal diseases

在实验室中(温度为(24±2)℃，相对湿度为(55±5)%，微尘数量在1 000个/m3以内)进行验证实验。首先打开气泵将混有孢子的气体吹集到涂有凡士林的PDMS薄片上。富集完成后，开启LED光源和CMOS芯片对PDMS薄片上的样本进行拍照获取衍射全息图，并将图像传至计算机分析处理。装置初步实现对病害真菌孢子进行定时富集、进样、拍摄，以及对图像进行重构和检测等操作。

2 结果与分析

为了评价本文装置的准确性，以及其他环境杂质等干扰物对稻瘟病孢子检测的影响，用稻瘟病孢子(中国水稻研究所提供)、杂质(主要包括微颗粒、菌丝等物质)进行检测实验,将本装置的计数结果与人工计数结果进行比较。

图11表明了PDMS薄片重复使用时的孢子检测准确率变化情况，当孢子累计数量分别在2 500个和3 000个左右时，准确率约为94%和90%，超过3 000个时，孢子重叠率较高，准确率明显下降。据文献[26]可知，一季水稻成长期为110 d左右，其中有大约一半的时间孢子浓度为0，剩下的一半时间中，约70%的时间内孢子浓度不到100个/m3,少数几天孢子浓度超过500个/m3。该装置每天工作2 h(孢子捕捉仪在凌晨孢子萌发时开启[27])，通常情况下，在孢子浓度为100个/m3时，装置使用110 d(一季水稻成长期)时，收集的孢子不到2 000个，故本装置无需更换PDMS薄片即可满足一季水稻监控预警需求。图12是一组实验结果，其中稻瘟病孢子轮廓用红色线条和数字标记,图12b是对图12a矩形框内图像的局部放大。稻瘟病孢子显微人工计数结果和自动计数结果如表1所示，误差(|N-M|/M×100%)最大不超过10%，平均误差5.91%，均属于可接受范围。图13是对两种方法进行Bland-Altman分析的结果，所有点均在95%一致性区间以内，一致性较好。实验结果表明，基于衍射重构技术的作物真菌病害微型检测装置可以检测并识别稻瘟病孢子，其自动计数结果与人工计数结果高度线性相关(决定系数R2为0.99)，平均误差为5.91%，在实验室条件下具有较好的准确性。

图11 薄片重复使用时孢子检测准确率Fig.11 Detection accuracy of repeated PDMS using

图12 装置检测结果Fig.12 Diagram of equipment test result

表1 人工计数与装置自动计数结果Tab.1 Manual counting and device automatic counting results

图13 Bland-Altman方法分析Fig.13 Analysis by Bland-Altman method

3 结束语

提出了一种基于衍射重构技术的作物真菌病害孢子检测方法，依据惠更斯-菲涅尔原理设计了作物真菌病害孢子微型检测装置。实验结果表明，所设计装置的检测结果和人工计数结果高度线性相关,决定系数为0.99，平均误差为5.91%，具有较好的准确性。装置体积为4 cm×4 cm×5 cm，且在实验室条件下测试可实现定时富集、进样、拍摄、重构和检测功能，为微型低成本作物真菌病害早期预警系统的研发提供了解决方案。