灵龟八法对衰老大鼠IL-10、IFN-γ活性及基因表达的影响*

赵彩娇，卢美静，蒋云芳，黄逸珠

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

随着人类生活水平的不断提高，如何延缓衰老，保持青春成为大众关注的话题之一。目前有关衰老机制的研究[1]有很多：免疫学说、细胞凋亡学说、自由基学说、神经内分泌学说等。谭成富等[2]从细胞凋亡学说方面入手，观察针灸对MIRI大鼠心肌自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达的影响，结果显示,电针或艾灸“内关”穴抑制了细胞凋亡,对MIRI大鼠心肌具有保护作用。李艳梅等[3]从自由基学说方面入手，研究不同时辰温针灸足三里、关元对老年人延缓衰老的影响，结果表明治疗组SOD含量比治疗前显著提升，针灸对于SOD含量具有促进作用。

该项目主要从免疫学说方面入手研究。免疫学说认为[4]：随着人年龄的增长，人体免疫功能随之减弱，会导致机体内免疫应答水平下降，以致不能及时抵御外邪，增加机体的患病机率。目前发现[5]灵龟八法按时开穴灸具有提高机体的免疫功能、延缓机体衰老进程的功效。然而，现阶段对灵龟八法关于免疫学说基因表达延缓衰老方面的研究甚少。为进一步探究，此项目以衰老模型大鼠为研究对象，观察灵龟八法对衰老模型大鼠脾脏组织IL-10、IFN-γ活性及IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表达的影响,探讨灵龟八法在免疫学说方面，延缓衰老的效果。进一步为灵龟八法按时开穴灸的作用机理，提供更多实验依据。

1 材料与仪器

1.1 动物

健康雄性SD大鼠48只，日龄40～50天，体质量200～250 g，动物由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号为:SCXK(湘)2016-0002。实验前，将实验大鼠适应性饲养1周，实验室要求每天光照与黑暗各12 h(光照时间为7:00—19:00),室温20～23℃，在此期间予以大鼠自由进食和饮水。实验过程中对动物的处置符合国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》要求[6]，实验全过程严格遵循“3R”原则。

1.2 药品及试剂

D-半乳糖(Sigma公司)；DP431RNApreppur 动物组织总RNA提取试剂盒(北京天根公司)；FP209 Talent 荧光定量检测试剂盒(SYBR Green，北京天根公司)；KR108 FastQuant RT Super Mix(北京天根公司)；大鼠细胞调节因子(IL-10、IFN-γ)ELISA 试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；艾绒(南阳绿莹艾草生物制品有限公司)。

1.3 仪器

Centrifuge 5810R离心机(德国Eppendorf公司)；BCD-210DCM冰箱(青岛海尔股份有限公司)；MDF-H73865医用低温箱(-80℃，日本三洋电机株式会社)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海鸿都电子科技有限公司)；SW-CJ-IFD洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；FA2204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 造模方法

采用秦氏造模方法[7]按500 mg/kg·d把D-半乳糖用0.9%的生理盐水配置成 10%的D-半乳糖溶液。除空白组外，其余组大鼠于每日进行腹腔注射D-半乳糖溶液，1次/天，连续60天。连续造模60天后，大鼠出现毛色枯黄无光泽、毛发易脱落、精神萎靡、行动迟缓、畏寒怕冷、四肢冰凉、小便增多等衰老症状。

2.2 处理方法

采用完全随机分组法，查随机数字表将大鼠分为 A组(空白组)、B组(模型组)、C组(脾俞加肾俞治疗组)、D组(灵龟八法治疗组)，每组12只。各组处理方法如下：

A 组:自由进食，每日称重，不造模，不治疗。

B组：每日称重，每日进行腹腔注射10%的D-半乳糖溶液，连续给药60天。造模结束后常规饲养30天，不予以治疗。

C组:每日称重，每日进行腹腔注射10%的D-半乳糖溶液，连续给药60天。造模结束后，在大鼠脾俞、肾俞穴进行艾炷灸治疗。施灸方法:根据《豚鼠针灸穴位图谱的研制》[8]大鼠穴位定位取穴，先将施灸部位脾俞穴和肾俞穴的体毛剪去，再涂以少量芦荟胶以固定艾炷，无癍痕灸，灸至以大鼠全身挣扎为度，每次连续3壮，1次/天 ，共30天。

D组:每日称重，每日进行腹腔注射10%的D-半乳糖溶液，连续给药60天。造模结束后，每日在大鼠灵龟八法所开穴位处，进行艾炷灸治疗。开穴方法：按照谢氏“灵龟八法开穴简表”[9]进行,选取当日实验治疗的时辰进行开穴。施灸方法:根据《豚鼠针灸穴位图谱的研制》[8]大鼠穴位定位取穴，先将施灸的开穴部位的体毛剪去，再涂以少量芦荟汁以固定艾炷，无瘢痕灸，每灸至以大鼠全身挣扎为度，每次连续3壮，1次/天，共30天。

2.3 样本采集

各组大鼠于实验结束次日取血后处死，于冰台上快速取脾脏组织，切碎组织，加入冰0.9%的生理盐水,用手动匀浆器制成10%的脾匀浆,4℃3 000 r/min,离心10 min,提取上清。另取200 mg脾脏组织，浸泡在RNA保存液中，放入-70℃冰箱贮存待检。

2.4 检测方法

2.4.1 酶联免疫吸附试验(Elisa) 用大鼠细胞调节因子IL-10、IFN-γ试剂盒检测脾脏组织中IL-10、IFN-γ含量。

2.4.2 基因表达检测 实时荧光绝对定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠脾脏IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表达量。以cNDA为模板进行实时荧光PCR分析：每个PCR反应体系内容如下：2×Talent qPCRPreMix 12.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，cDNAΜl，ddH2O 11 μL。采用相对定量ΔΔCT法，PCR反应条件：95℃预变性15 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40个循环。PCR反应结束后进行熔解曲线分析以验证PCR扩增产物的特异性。反应结束获得IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA的循环阈值(cycle threshold ,Ct)，采用 △△Ct( △△Ct=△Ct-△Ct基础值，△Ct=Ct目的基因-Ct内参)方法分析,根据2-△△Ct公式计算基因的相对表达量。见表1。

表1 IL-10、IFN-γ引物序列

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 各组大鼠脾脏组织中IL-10、IFN-γ含量情况

D组IL-10含量明显高于B组(P<0.05)，与A组相比下降(P<0.05)，差异有统计学意义;D组与C组相比较(P>0.05)，差异无统计学意义。D组IFN-γ明显低于B组(P<0.05)，与A组相比上升(P<0.05)，差异有统计学意义;D组与C组相比较(P>0.05)，差异无统计学意义。表明灵龟八法开穴灸有效地减少了衰老模型大鼠IFN-γ的含量，减轻了致炎因子在衰老模型中介导的炎症刺激,同时增加了大鼠IL-10的数目，降低机体局部炎性细胞因子的活性，有效地缓解了机体衰老。见表2。

表2 各组大鼠脾脏组织中IL-10、IFN-γ含量比较

注：与B组比较,1)P<0.05；与A组比较,2)P<0.05；与C组比较,3)P>0.05。

3.2 各组大鼠脾脏组织中IFN-γ mRNA基因表达量情况

D组IFN-γ mRNA明显低于B组(P<0.05),与A组相比上升(P<0.05)，差异有统计学意义;D组与C组相比较(P>0.05)，差异无统计学意义。表明灵龟八法开穴灸有效减少衰老模型大鼠促炎因子IFN-γ mRNA基因数目的生成，减轻了亚急性衰老模型大鼠机体内的炎症反应，有效缓解衰老。见图1。

3.3 各组大鼠脾脏组织中IL-10 mRNA基因表达量情况

D组IL-10 mRNA明显高于B组(P<0.05),与A组相比，显著下降(P<0.05)，差异有统计学意义;D组与C组相比较(P>0.05)，差异无统计学意义。提示灵龟八法开穴灸增加了衰老大鼠抗炎因子IL-10 mRNA的基因数目，对D-半乳糖引起的亚急性炎症反应起到了一定的保护作用。见图1。

注:与B组比较,●P<0.05 ；与A组比较,■P<0.05；与C组比较,□P>0.05。图1 各组大鼠脾脏组织中IFN-γ mRNA、IL-10 mRNA基因表达量

4 讨论

近年，医学界对灵龟八法延缓衰老进行了研究：陈栋[10]研究灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠血清免疫球蛋白的影响，实验表明提高了阳虚模型大鼠免疫球蛋白浓度水平。毛楠[11]探讨灵龟八法抗衰老的机理,结果显示灵龟八法对老年脾虚患者SOD的含量具有调整作用，达到了延缓衰老的目的。

灵龟八法是时间针灸学的重要组成部分，以时间概念为先决因素，是体现“因时制宜”的一种治疗方法[12]。灵龟八法把天时的变化特点与人体奇经八脉气血开阖盛衰的特点相结合，选取八脉交会穴进行治疗。调整了人体内奇经八脉气血运行，进一步疏通十二经络，调节十二经脉的气血盛衰，达到防病治病、延缓衰老的目的。本研究结果表明,灵龟八法有效地调整了衰老模型大鼠脾脏组织中IL-10、IFN-γ活性及IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表达，有效地减少了致炎因子的生成，增加了抗炎因子数量。

衰老引起的最明显的现象是免疫系统的失调，包括免疫衰退和慢性炎症两方面[13]。免疫系统功能衰退减弱了机体的免疫保护作用，同时产生了慢性炎症的反应，增加了获得自身免疫性疾病的机率[14]。本实验采用注射D-半乳糖制造亚急性衰老大鼠模型。D-半乳糖造模可在机体内引起亚急性的炎症反应[15]，使鼠体内组织器官出现类似衰老的退行性变,发生免疫功能低下、生化改变、基因表达与调控异常等与自然衰老相似的症状。

IL-10是人体内重要的抗炎因子，是Th2 细胞因子之一，它对D-半乳糖引起的亚急性炎症反应具有一定的保护作用。研究发现,IL-10是抗炎与免疫抑制性细胞因子[16]，可抑制多种炎性介质释放，减少促炎细胞因子分泌，发挥免疫调节、维持细胞因子平衡的作用。另外，IL-10通过 NF - κB 信号通路抑制促炎症因子的合成与分泌，可下调炎症反应的瀑布效应[17]。灵龟八法治疗组IL-10活性及IL-10 mRNA基因表达量明显高于模型组(P<0.05)，与空白组相比下降(P<0.05)。灵龟八法按时开穴灸增强了大鼠IL-10的活性，增加了IL-10 mRNA基因的数目，降低了机体局部炎性细胞因子的活性反应，减少了脾脏组织中局部中性粒细胞的浸润、活化，从而减轻脾脏细胞的损害，起到了对脾脏细胞的保护作用。这可能是灵龟八法延缓衰老的免疫机制。

INF-γ是TH1细胞释放的代表性的致炎因子之一,主要起免疫调节作用[18]。它能促进T、B细胞分化，是一种强有力的吞噬细胞及中性粒细胞的激活物。有研究表明,IFN-γ可诱发巨噬细胞的炎症吞噬反应[19]。当发生感染时，维持着动态平衡的二者会出现比例失调，从而引起机体的炎症反应。另外，IFN-γ可激活体内血管内皮细胞，促进炎性细胞的合成与分泌，诱导中性粒细胞释放炎症蛋白与炎症介质[20]。本研究发现，衰老大鼠IFN-γ含量及IFN-γ mRNA基因表达量明显低于模型组(P<0.05)，与空白组相比上升。灵龟八法有效抑制了衰老模型大鼠IFN-γ的活性，减少了IFN-γ mRNA基因数目，抑制了大鼠脾脏组织的巨噬细胞活化，减少了巨噬细胞的大量侵袭，有效抑制D-半乳糖引起的炎症反应，并恢复了机体的抗炎平衡,这是其延缓衰老的一个重要方向。

总之，灵龟八法按时开穴灸有效地调整了衰老模型大鼠脾脏组织中IL-10、IFN-γ活性及IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA基因表达。减少了致炎因子的生成，增加了抗炎因子数量，减轻机体内的炎性刺激，保护了脾脏组织，起到延缓衰老的作用，再一次证明了灵龟八法延缓衰老的机理与调节免疫系统机制有密切联系。