骨硬化蛋白单克隆抗体单用与联合黄芪对去卵巢诱导的骨质疏松疗效比较

孙帅波，陈少敏，林晋体，周呈伟，水小龙

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.骨科；2.康复科）

骨质疏松症是一种骨密度降低，骨显微结构改变从而导致骨骼的强度下降，易导致骨折的一种骨骼疾病[1-2]。近年来骨质疏松患者逐年增加，骨质疏松相关性骨折已成为一大难题，对临床医师来说防治骨质疏松已经是一项艰巨而富有挑战的任务[3-4]。研究发现可以使用骨硬化蛋白单克隆抗体（sclerostin-antibody，Scl-Ab）拮抗骨硬化蛋白引起的骨形成负向调节作用[5]，从而抑制骨丢失来治疗骨质疏松，其疗效较好[6-7]。但大量长期使用Scl-Ab后可能出现一些并发症，还可能刺激机体产生针对Scl-Ab的相关抗体，使药物疗效降低[8]。研究显示黄芪（Astragalus membranaceus）可以使血清钙、磷、骨钙素及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平显著升高。黄芪还可以减少雌激素下降所引起的骨质疏松症患者的骨量丢失，其机制主要是通过减少骨质破坏、增加骨形成、抑制骨吸收从而达到骨量的增加[9-10]。本研究比较Scl-Ab联合黄芪与单用Scl-Ab治疗去卵巢诱导的骨质疏松的疗效。

1 材料和方法

1.1 材料 Scl-Ab（美国MSD公司）、黄芪液（从膜荚黄芪中提取）[11]、手术操作器械（美国Stryker医疗器械公司）、Micro-CT（型号SkyScan1176，荷兰）。硬组织切片机（型号EXAKT300，德国）、钙黄绿素及四环素（美国Sigma公司）、Image-Pro Plus图像分析仪（美国Media Cybernetics公司）、显微镜（ZEISS Axio Imager M1，德国）。

1.2 方法

1.2.1 建立骨质疏松动物模型及治疗：3～4个月龄健康雌性SD大鼠30只，体质量200～240 g。从上海斯莱克实验动物公司购入，实验动物许可证号：SCXK（沪）2007-005。30只大鼠随机分为手术组（OVX组，n=25）和假手术组（Sham组，n=5）。手术前30只大鼠均称体质量，根据体质量以10%水合氯醛3 mL/kg进行腹腔注射麻醉，麻醉起效后再在大鼠背侧正中线中下1/3处行一长约2 cm纵行切口，逐层钝性分离皮下组织至脊柱旁开0.5 cm处，拨开肌肉组织、显露卵巢，OVX组轻提卵巢结扎输卵管卵巢交界处，切下双侧卵巢，然后缝合关闭创口，Sham组直接缝合关闭创口。术后3 d给予肌注青霉素（2.5万U/kg）预防感染。正常饲养12周后2组各取5只大鼠处死并取股骨行Micro-CT检测，用于检测骨质疏松动物模型是否建立。建模成功后将剩下的OVX组大鼠随机的分成2组：Scl-Ab组、Scl-Ab+黄芪组。Scl-Ab组：给予Scl-Ab皮下注射（25 mg/kg，每周2次），并且每天给予200 mg/kg 0.9氯化钠溶液灌胃，直至12周[11-12]；Scl-Ab+黄芪组：Scl-Ab皮下注射（12.5 mg/kg，每周2次），同时每天给于200 mg/kg黄芪液灌胃，直至12周。每周称体质量并调整药物剂量。分别在治疗第71天和第81天，所有大鼠腹腔注射钙黄绿素及四环素（15 mg/kg）[13]。

1.2.2 Micro-CT检测：药物治疗12周后处死大鼠，取下所有大鼠双侧股骨，剔除软组织，0.9%氯化钠溶液冲洗后，马上用4%的多聚甲醛固定用于Micro-CT检测。将左侧股骨置于仪器上，股骨远端骺线下方为扫描兴趣区。CT扫描后进行3D重建，在去除骨皮质影像图案后进行定量分析。获得大鼠股骨远端骺线下方检测区域骨微结构参数：骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb．Th）、骨小粱分离度（trabecular spacing，Tb．Sp）、骨小粱数量（trabeculae number，Tb．N）、连接密度（connective density，Conn.D.）及股骨骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.2.3 硬组织切片：待所有股骨经过Micro-CT检测后，用4%多聚甲醛固定所有标本，梯度乙醇脱水，甲基丙烯酸甲酯包埋。随后用硬组织切片机沿股骨纵轴冠状面将组织包埋块进行切片，切片厚度为30～40 μm左右；随后进行清洗、打磨、抛光、Masson染色，使用光镜及荧光显微镜观察钙黄绿素条带，并用Image-Pro Plus 6.0全自动图像分析仪计算骨矿化沉积率（mineralization deposition rate，MAR）。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料且符合正态分布用来表示，2组计量资料间比较用成组t检验，计数资料比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠骨质疏松模型的构建 术后12周大鼠的Micro-CT检测结果，Sham组骨小梁更粗，骨质也更加紧密，股骨BMD为（230.89±27.63）mg/cm2，而OVX组为（158.24±25.67）mg/cm2。与Sham组比，OVX组大鼠的BMD降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表明建模成功，见图1。

2.2 2组大鼠BMD的比较 Scl-Ab组和Scl-Ab+黄芪组各1只大鼠因麻醉过量、手术创伤和伤口感染死亡；最终共18只大鼠进入检测评估。药物使用12周时大鼠股骨的Micro-CT检测，Scl-Ab组股骨BMD为（176.78±28.23）mg/cm3，Scl-Ab+黄芪组股骨BMD为（215.79±27.86）mg/cm3；与Scl-Ab组比，Scl-Ab+黄芪组骨量增多，骨质更紧密，股骨BMD增加了22.07%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 2组Micro-CT三维重建图像分析及骨微观参数的比较 Scl-Ab+黄芪组Tb.N的数量要明显多于Scl-Ab组，而且骨小梁更粗、联系紧密，见图2。与Scl-Ab组比，骨微观参数也显示Scl-Ab+黄芪组有更高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D和更低的Tb.Sp，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 2组硬组织切片结果的比较 治疗12周后Scl-Ab+黄芪组硬组织切片中股骨远端Tb.N的量明显多于Scl-Ab组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且骨小梁排列更有规律、更紧密。荧光共聚焦显微镜下观察进一步证实了Micro-CT的结果。用荧光共聚焦显微镜经Image-Pro Plus 6.0计算Scl-Ab组MAR为（0.80±0.09），Scl-Ab+黄芪组为（1.56±0.10），2组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 2组大鼠股骨干骺端Micro-CT三维重建结果

表1 治疗12周时2组大鼠左股骨干骺端骨微观参数比较（每组n=9，

表1 治疗12周时2组大鼠左股骨干骺端骨微观参数比较（每组n=9，

与Scl-Ab组比：aP＜0.05

Scl-Ab+黄芪组 2.987±0.115a 0.174±0.016a 0.401±0.013a 0.345±0.037a 89.421±13.564a Scl-Ab组 2.270±0.090 0.123±0.011 0.198±0.016 0.610±0.129 46.723± 9.120

图3 用药物12周时Scl-Ab组和Scl-Ab+黄芪组大鼠股骨干骺端Masson染色和股骨四环素-钙黄绿素标记结果

3 讨论

引起绝经后骨质疏松的主要原因是雌激素的缺乏，属于高转化型[14]。雌激素的不足使得成骨和破骨的平衡被打破，会直接影响骨质，最终可能导致病理性骨折[15-16]。目前用于治疗骨质疏松的药物很多，但都有自身的局限性。如二膦酸盐类人体吸收率低，肾功能不全的患者者或有血栓栓塞性疾病的患者不适合使用；甲状旁腺素类使用不方便，且不能用于骨骺线尚未闭合的儿童及青少年患者[17]；地诺单抗则容易导致下颌骨坏死[18]。Scl-Ab是一种非常有潜力的药物，目前治疗效果较好[19]。但也有人提出Scl-Ab存在一定不良反应，可能发生同Van Buchem病和骨硬化病类似的症状，如因为颅骨增生从而压迫到颅神经、脊柱椎管狭窄症或者椎间孔增生压迫到周围神经等症状。另一方面，临床前期实验发现，使用Scl-Ab后受试者体内的血清钙会轻度降低，甲状旁腺素会随之代偿性升高，血清钙又会回到正常值。这种情况对于普通患者的风险较低，但如果是肾脏疾病或维生素D缺乏症的患者则存着一定风险。同时对一些免疫系统紊乱的患者来讲，可能会影响Scl-Ab的药代动力学或增加药物毒性，又或者可能使机体产生相应的抗体，降低药效[10]。

黄芪为蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，性微温，味甘，归肺脾经，助气，壮筋骨，具有健脾补中、益气固表、升阳举陷、敛汗固脱之功[20]。文献记载黄芪还具有补肾作用，也有防治骨量丢失及骨质疏松的作用[21]。黄芪可以显著提高血中磷、钙、骨钙素及ALP。

本研究通过对大鼠去势来建立骨质疏松模型，一般状况下饲养3个月后经Micro-CT检测股骨BMD及骨量减少情况来确定骨质疏松建模是否成功。通过黄芪和Scl-Ab的联合使用和Scl-Ab单独使用分别来治疗去卵巢诱导的骨质疏松，药物治疗12周后处死所有大鼠并取股骨行硬组织切片、Micro-CT等评估。研究发现，在用药12周后Scl-Ab+黄芪组可以看见更多的骨小梁，且小梁之间排列更整齐、更紧密，而Scl-Ab组相对来讲股骨干骺端骨小梁排列较稀疏，且部分骨小梁之间联系欠紧密。用Micro-CT测定各组的BMD发现Scl-Ab+黄芪组要明显高于Scl-Ab组。Scl-Ab+黄芪组与Scl-Ab组相比较，BV/TV、Tb.N、Tb.Th都增高，而Tb.Sp降低；Scl-Ab+黄芪组的MAR也明显高于Scl-Ab组，这表明黄芪和Scl-Ab的联合使用相较于单用Scl-Ab可以明显增加去势大鼠股骨BMD，提高股骨干骺端骨小梁的质量，加速骨质的矿化，对提高骨量效果更显著。

本研究提示黄芪和Scl-Ab的联合使用相较于单用Scl-Ab在抗骨质疏松方面效果更好。联合应用黄芪可以降低Scl-Ab的使用量，有助于降低使用Scl-Ab时所带来的不良反应，并且提高了治疗效果。