一个遗传性蛋白C缺陷症家系表型与基因突变分析

刘媚娜，苏看看，张海月，金艳慧，杨丽红，李小龙，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

蛋白C（protein C，PC）是由肝脏合成的一种维生素K依赖性糖蛋白，为机体PC抗凝系统中的中心成分，其本身是无活性的酶原，在体内被水解成活化蛋白C（activated protein C，APC）。APC具有抗凝、促纤溶和维持血管内皮屏障稳定等功能[1]。PC缺乏可使机体处于高凝状态，易导致血栓形成。遗传性PC缺陷症通常为常染色体显性遗传，与蛋白C基因（PROC）的突变有关[2]。本研究对1例遗传性PC缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析，发现了导致该家系致病的PROC基因突变位点，并采用生物信息学软件对突变位点进行分析，初步探讨其分子致病机制。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者，女，39岁，5年前患有“下肢深静脉血栓形成”，之后长期不规则口服华法林进行抗凝治疗。2周前，由于自行停用华法林5 d，后因下肢疼痛而入院。辅助检查显示，左腿深静脉血栓形成，抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）阳性，血浆PC活性（PC∶A）为39%（70%～130%），其他凝血相关指标均在参考范围内，被诊断为“PC缺乏、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、下肢深静脉血栓形成和疑似鼻窦血栓形成”。住院后期，头颅MRI显示静脉窦血栓形成和脑梗死，尿激酶溶栓治疗后死于颅内出血。共调查先证者及家系其他成员3代6人，肝、肾功能均无异常。先证者的父亲在47岁时死于脑静脉窦血栓形成，哥哥在44岁时因肺静脉栓塞而死亡。家系遗传图谱见图1。选择100名健康体检者建立本次实验室凝血表型指标正常参考值和用于突变多态性的筛查。年龄22～56岁，男53名、女47名，无肝、肾功能异常且无其他基础性疾病。本通过本院伦理委员会审查，实验前所有受检者均签署知情同意书。

图1 遗传性PC缺陷症家系图

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理：采集受检者外周静脉血2.7 mL，以109 mmol/L枸橼酸钠1∶9抗凝，3 000 r/min离心10 min，上层血浆用于凝血指标检测，2 h内检测完毕；下层血细胞用于提取基因组DNA，并进行PCR扩增及测序。

1.2.2 血浆表型指标检测：在Stago STA-R全自动血凝仪（法国Stag公司）上用发色底物法检测血浆PC∶A、蛋白S活性（PS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A），免疫比浊法检测D-二聚体（D-D）。采用ELISA法检测蛋白C抗原（PC∶Ag）（试剂盒均购自温州长风公司）。

1.2.3 PROC基因检测：基因组DNA提取试剂盒提取先证者及家系成员外周血基因组DNA。参照文献[3]设计合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。在ABI Thermalcycler 2720上PCR扩增PROC基因所有外显子及侧翼序列。PCR体系为25 μL。PCR反应程序为：①在95 ℃变性5 min；②变性（95 ℃）、退火和延伸（72 ℃）各30 s，共30个循环；③72 ℃再延伸10 min。基因组DNA提取及PCR扩增试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。纯化后的PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行正、反向测序。在Blast上比对测序结果与美国NCBI基因文库的PROC基因序列，找寻突变位点。选择100个个体以排除多态性。家系成员基因检测仅限先证者基因突变区域。

1.2.4 FV Leiden突变和凝血酶原20210G＞A突变检测：对先证者的F5基因第10外显子和F2基因第14外显子进行PCR扩增，扩增产物直接测序分析。

1.2.5 蛋白质生物学特性分析：用ClustalX-2.1-win判断突变氨基酸在物种进化过程中的保守性。用PolyPhen-2评估突变氨基酸对PC功能和/或结构的可能影响。通过Swiss-PdbViewer软件和PIC程序分析突变引起蛋白质空间结构的改变。

2 结果

2.1 凝血指标检测结果 先证者、其儿子和二姐的血浆PC∶A与PC∶Ag均平行下降，为39%～58%。先证者的D-D为20.0 mg/L。先证者的母亲、大姐和丈夫的PC和D-D均在正常范围内。所有家庭成员的PS∶A和AT∶A都正常。见表1。

2.2 基因突变检测结果 先证者、其儿子和二姐均在PROC基因的9号外显子携带c.997G＞A杂合错义突变，导致p.Ala291Thr，家系其他成员均为野生型（见图2及表1）。该基因型结果与血浆PC表型结果一致。在100个对照个体中未检测到此突变，初步排除基因多态性可能，经查阅文献和人类基因突变数据库，发现其为新的突变。

表1 遗传性PC缺陷症家系成员表型及基因型检测结果

图2 PROC基因第9外显子测序结果

2.3 蛋白质生物学特性分析 同源序列比对结果表明Ala291在9种同源物种中不是高度保守。Poly-Phen-2软件评分为0.850，提示“可能有害的”。蛋白质模型分析显示：在野生型PC中，非极性疏水的Ala291不与其他氨基酸连接。突变为极性亲水的Thr291后，Thr291与Pro327之间新增一氢键，导致蛋白质结构改变（见图3）。

图3 PC蛋白质模型图

3 讨论

PC系统是体内重要的生理性抗凝系统，PC活化后与辅助因子蛋白S结合，灭活活化的凝血因子V（FVa）和活化的凝血因子V III（FV IIIa），限制凝血酶的产生，从而发挥抗凝作用。PC缺陷症常导致血栓形成，通常表现为静脉血栓，而且PC水平越低，血栓形成的趋势越高[4]。国外研究表明杂合子PC缺陷症在有遗传性血栓形成倾向的家庭和健康人口中的发生率分别为6%和0.2%[5-6]。在中国，PC缺陷症在静脉血栓患者的患病率约为8%[7]。本研究中，先证者因左腿深静脉血栓入院，辅助检查发现血浆PC∶A为39%，PC∶Ag为45%。基因分析显示PROC基因第9号外显子存在c.997G＞A杂合突变，导致p.Ala291Thr突变。其儿子和二姐亦存在该杂合突变。排除FV Leiden突变和凝血酶原20210G＞A突变等其他因素，诊断为I型遗传性PC缺陷症。根据家系图的显示，推测此突变遗传自其父亲，由于先证者父亲已故未能采集到样本。家系成员中，先证者、其儿子和二姐均携带p.Ala291Thr杂合突变，儿子和二姐无静脉血栓形成临床表现，而先证者具有严重的复发性静脉血栓栓塞，可能原因是先证者同时患有SLE，APC抵抗加剧了血栓形成[8]。PROC基因缺陷患者是否出现血栓形成临床症状可能是多种环境因素（如妊娠、外伤、服用避孕药、吸烟、长期制动等）与基因突变共同作用的结果[9]。

PC缺陷症按照产生的原因不同可分为遗传性PC缺陷症和获得性PC缺陷症。遗传性PC缺陷症通常由PROC基因突变所致。PROC基因位于2号染色体2q13-q14，包括9个外显子和8个内含子。外显子9区由886个碱基组成，前590个碱基编码PC第224至第419位氨基酸，均在重链区，主要为C端丝氨酸蛋白酶区域，是PC的活性区域[10]。该家系携带的p.Ala291Thr杂合错义突变位正发生于此区，可能影响PC活性。进一步研究表明，Ala291位于PROC基因的催化结构域（催化三联体：H211-D257-S360），其主要包括Ca2+结合环（残基225-235）和自溶环（残基302-317）[11]。自溶环有助于稳定蛋白质的活化肽，在APC的抗凝血功能中起关键作用，在Ca2+结合环的共同作用下水解灭活FVa[12]。蛋白质模型分析显示Ala291位于自溶环附近的催化区域。Ala291被Thr291取代后，Thr291与Pro327形成额外的氢键，形成的超强分子间力可能会扰乱催化活性，导致PC活性的降低。

综上所述，本研究中我们对1个遗传性PC缺陷症家系进行实验室表型和基因型进行检测，发现了p.Ala291Thr杂合错义突变，并通过生物学分析软件初步探讨了其可能的分子致病机制，认为该家系PC水平减低与p.Ala291Thr杂合错义突变有关，但其确切的分子致病机制有待进一步研究。