沉默信息调节因子3在丹酚酸A抗紫外线诱导视网膜色素上皮细胞氧化应激性损伤中的作用及机制

李霞，王彦方，陈战巧，俞颂平

（温州医科大学附属第五医院 眼科，浙江 丽水 323000）

老年性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种以布鲁赫膜和视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）之间玻璃膜疣堆积为特征、以视力不可逆性下降为表现的老年性眼部疾病[1]。研究认为AMD的发生与新生血管形成、炎症反应、氧化应激性损伤、自身免疫反应等有关[1]。过度紫外线照射已被认为是AMD发生的外在因素，能够诱发RPE细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，激发细胞内氧化应激性损伤，且清除细胞内ROS，能够有效降低紫外线诱导的RPE损伤[2-3]。我们前期研究证实丹酚酸A（salvianolic acid A，Sal A）作为一种氧化清除剂[4-5]，对紫外线诱导RPE氧化应激性损伤具有保护作用[3]，但其具体分子机制仍未完全明确。沉默信息调节因子3（silent information regulator 3，SIRT3）是一种NAD+依赖的 III型组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），在人类RPE细胞中呈高表达，参与RPE的多种生物学功能，尤其与RPE氧化应激损伤密切相关[6]。本研究进一步探讨SIRT3在Sal A抗紫外线诱导的ARPE-19细胞损伤的分子机制，为应用Sal A预防和治疗AMD提供科学根据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 Sal A（货号：96574-01-5）购自上海阿拉丁公司，DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗、FBS、胰蛋白酶购自英国Gibco公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐、二甲基亚砜购自美国Sigma公司；SIRT3、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）、Bax、bcl-2、cleaved-Caspase3、Cyt c和β-actin单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。ROS检测试剂盒购自北京Solarbio公司，CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒（WST-8法）和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，si-SIRT3、si-RNA购买于美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养与分组 将人ARPE-19细胞（购自中国科学院细胞库）培养种植于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，取对数生长细胞进行实验。取1×105接种于96孔板或1×106个细胞接种于6孔板中，将ARPE-19细胞按照不同处理条件分组：对照（Sal A）组、UV（30 mJ/cm2紫外线照射）组、5 μmol/L Sal A（5 μmol/L Sal A预处理30 min后30 mJ/cm2紫外线照射）组、25 μmol/L Sal A（25 μmol/L Sal A预处理30 min后30 mJ/cm2紫外线照射）组、50 μmol/L Sal A（50 μmol/L Sal A预处理30 min后30 mJ/cm2紫外线照射）组。

1.3 细胞转染 按细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板，待细胞融合至80%左右时，将5 μL阴性si-RNA和si-SIRT3质粒与5 μL Lipofectamine 2000试剂（美国Invitrogen公司）混合于200 μL无FBS、无双抗培养基，加入ARPE-19细胞，置于37 ℃培养箱中过夜，次日更换含有10% FBS、双抗的新鲜培养基，继续培养48 h。按照转染情况将细胞分为对照（Sal A）组、UV（30 mJ/cm2紫外线照射）组、Sal A+UV（50 μmol/L Sal A预处理30 min后30 mJ/cm2紫外线照射）组、Sal A+UV+阴性si-RNA（经si-RNA质粒转染细胞，用50 μmol/L Sal A预处理30 min后，30 mJ/cm2紫外线照射）组、Sal A+UV+si-SIRT3（经si-SIRT3质粒转染，用50 μmol/L Sal A预处理30 min后30 mJ/cm2紫外线照射）组。

1.4 细胞活性检测 将1×105个ARPE-19细胞接种于96孔板中，按照分组方法处理，并继续培养48 h后，每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，37 ℃恒温箱孵育4 h，弃去上清液，加入二甲基亚砜120 μL终止反应。酶标仪中检测各孔的吸光光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=实验组A/对照组A×100%。

1.5 细胞凋亡检测 取1×106个细胞接种至6孔板中，经处理48 h后，收集细胞悬液，以1 500 r/min离心，弃上清，再次重悬、离心、弃上清后，加入500 μL缓冲液，吹散细胞。将5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI依次加入、混匀，室温下避光孵育15 min，上机检测。

1.6 ROS水平检测 采用DCFH-CA方法检测细胞内ROS水平。将细胞密度为1×106个/孔的ARPE-19接种于6孔板，经处理48 h后，按照ROS检测试剂盒说明书进行操作。用终浓度为10 μmol/L的DCFH-CA重悬细胞，置入37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，以无血清细胞培养液洗涤3次后，转至流式细胞仪检测平均荧光强度。

1.7 SOD2活性检测 采用WST-8法检测细胞内SOD2活性。将细胞密度为1×106个/孔的ARPE-19接种于6孔板，经处理后，预冷的PBS洗涤2次。收集细胞，加入预冷的PBS匀浆，取匀浆液4 ℃离心，收集上清液。经BCA法进行蛋白定量后备用。按照CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒（WST-8法）说明书配制WST-8/酶液和反应启动液。取20 μL样品，依次加入160 μL WST-8/酶液和20 μL反应启动液，37 ℃孵育30 min。在波长为450 nm时，测定吸光度。

1.8 Western blot检测 各组细胞用预冷PBS漂洗3次后，加入150 μL RIPA细胞裂解液，冰上裂解15 min，EP管收集细胞裂解液，置于4 ℃离心机，12 000 r/min离心15 min，取上清。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，取20 μg总蛋白用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离，电转至PVDF膜上；经3%脱脂奶粉封闭1 h，加入适量比例的SIRT3、SOD2一抗，置于4 ℃冰箱过夜。用 PBST缓冲液洗膜后，按1：20 000加入HRP标记的二抗室温孵育2 h。再次洗膜后，用ECL试剂显影。

1.9 RT-qPCR检测 总RNA用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）抽提，即加入1 mL Trizol试剂吹下细胞，加入200 μL氯仿，EP管内静置15 min后，置于4 ℃离心机，12 000 r/min离心15 min。取上清，用1 mL 75%乙醇洗涤，再次离心，弃上清、干燥后，取RNA沉淀物。mRNA反转录反应，按照PrimeScript RT Master Mix（大连Takara公司）说明书合成cDNA。进行PCR检测，将反转录物用SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒（大连Takara公司）在ABI500 PCR仪上进行RT-qPCR扩增、检测。SIRT3引物：上游5’-CGCTAAACTTCTCCCGGGTT-3’，下游5’-ACACTAGTCCT CGCCAAACG-3’；SOD2引物：上游5’-GCCTCCCTGACCTG CCTTAC-3’；下游： 5’-GTGATTGATATGGCCCCCG-3’；GAPDH引物：上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；使用2-△△CT法分析SIRT3、SOD2 mRNA表达情况。

1.10 统计学处理方法 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。数据以s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sal A抑制紫外线诱导SIRT3表达 与对照组比，UV组SIRT3表达量明显降低（P＜0.05）；与UV组比，5、25、50 μmol/L Sal A处理后，细胞内SIRT3表达量明显增加（P＜0.05）。见图1。

图1 Sal A抗UV抑制SIRT3蛋白和mRNA的表达

2.2 SIRT3在Sal A抗紫外线诱导RPE细胞损伤的作用 与对照组相比，UV组细胞存活率明显下降（P＜0.05）；与UV组相比，Sal A+UV组细胞存活率明显增加（P＜0.05）；与Sal A+UV组相比，Sal A+阴性si-RNA+UV组细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3组细胞存活率明显降低（P＜0.05）；与Sal A+阴性si-RNA+UV组相比，Sal A+UV+si-SIRT3组细胞存活率明显降低（P＜0.05）。见图2。

2.3 SIRT3在Sal A抗紫外线诱导ARPE-19细胞凋亡的作用 与对照组相比，UV组细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表达量增加，Bcl-2表达量下降（P＜0.05）；与UV组相比，Sal A+UV组细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表达量降低，Bcl-2表达量增加（P＜0.05）；与Sal A+UV组相比，Sal A+阴性si-RNA+UV组细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表达量降低（P＜0.05），Bcl-2表达量差异无统计学意义（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3组细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表达量降低，Bcl-2表达量明显增加（P＜0.05）；与Sal A+阴性si-RNA+UV组相比，Sal A+UV+si-SIRT3组细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、Cyt c表达量明显增加，Bcl-2表达量下降（P＜0.05）。见图3。

2.4 SIRT3在Sal A抗紫外线诱导ARPE-19细胞氧化应激的作用 与对照组相比，UV组ROS水平升高，SOD2活性、蛋白和mRNA表达下降（P＜0.05）；与UV组相比，Sal A+UV组ROS水平降低，SOD2活性、蛋白和mRNA表达量增加（P＜0.05）；与Sal A+UV组相比，Sal A+阴性si-RNA+UV组ROS水平、SOD2活性、蛋白和mRNA表达量无明显差异（P＞0.05），Sal A+UV+si-SIRT3组ROS水平升高，SOD2活性、蛋白和mRNA表达量下降（P＜0.05）；与Sal A+阴性si-RNA+UV组相比，Sal A+UV+si-SIRT3组ROS水平增加，SOD2活性、蛋白和mRNA表达降低（P＜0.05）。见图4。

图2 SIRT3在Sal A抗UV抑制细胞存活的作用

3 讨论

图3 SIRT3在Sal A抗UV诱导细胞凋亡的作用

图4 SIRT3在Sal A抗UV诱导氧化应激的作用

SIRT3定位于线粒体基质，能促使多种抗氧化物酶去乙酰化，调节细胞内氧化应激，维持细胞正常生理功能[7]。SIRT3高表达于视网膜组织，主要分布于内外丛状层和视网膜色素上皮细胞[6，8]，参与抵抗细胞氧化应激损伤和视网膜血管新生的调控[9-10]。研究发现胰高血糖素样肽I类似物能够增加SIRT3的表达，抑制过氧化氢诱导的R28细胞损伤作用[11]。本研究发现UV照射后，细胞存活率下降，细胞凋亡，Bax、cleaved-Caspase3、cyt c表达量增加，而SIRT3、Bcl-2表达量显著下降；经Sal A预处理后，细胞存活率增加，细胞凋亡，cleaved-Caspase3、Cyt c表达量下降，SIRT3、Bcl-2表达量显著增加；用si-SIRT3干扰后，Sal A抗UV诱导细胞损伤的作用明显减弱，表现为：与Sal A+UV组相比，Sal A+si-SIRT3+UV组细胞存活率下降，细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase3、cyt c表达量增加，Bcl-2表达量下降；提示Sal A的抗UV诱导的细胞损伤与其增加SIRT3表达有关。

SOD2作为位于线粒体的抗氧化物酶，能够将超氧离子转化成过氧化氢和水，维持细胞内ROS平衡[12]。SIRT3能直接与SOD2的乙酰化位点结合，使SOD2去乙酰化，增加SOD2活性，形成SIRT3-SOD2通路，是重要的抗氧化通路[13-15]。QIU等[14]发现SIRT3使SOD2去乙酰化，增加细胞对氧化应激性的耐受性。CHEN等[15]表明木褪黑素能够激活SIRT3介导的SOD2活性，降低细胞内ROS水平。LIU等[16]证实外源性增加SIRT3表达，SOD2的赖氨酸68位点乙酰化，抵抗糖尿病氧化应激性损伤。本研究中，与UV组相比，Sal A+UV组SIRT3表达量明显增加，SOD2活性、蛋白和mRNA表达量也明显增加，提示Sal A增加SOD2活性及表达可能与其诱导SIRT3表达有关。经si-SIRT干扰后，与Sal A+UV组相比，Sal A+si-SIRT3+UV组的SOD2活性、蛋白和mRNA表达量均明显下降，说明SIRT3可能是Sal A增加SOD2表达量和活性的关键靶点。

综上所述，紫外线照射下，ARPE-19细胞内SIRT3表达量下降，SOD2的表达、活性降低，细胞氧化应激性损伤被激发，Sal A能够增加细胞内SIRT3的表达量，进而增加SOD2的活性和表达量，抵抗UV诱导的氧化应激性损伤。