稻瘟病菌产孢技术和防治方法概述

韩玉 吴尧 王林

摘 要：该文总结了稻瘟病菌的分离方法、适合产孢的培养基、温度和pH、保存方法以及主要防治技术的研究进展，以期为稻瘟病菌生理小种的鉴定和治病机理的研究提供参考。

关键词：稻瘟病菌；分离方法；保存方法；防治方法

中图分类号 S435 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0057-03

Abstract：According to the research progress，the isolation methods of Magnaporthe oryzae，the medium suitable for sporulation，temperature and pH，the preservation methods，and the main control methods were summarized，in order to lay the foundation for the identification and treatment mechanism of the pHysiological race of Magnaporthe oryzae，and to improve the quality of rice as a reference.

Key words：Magnaporthe oryzae；Separation method；Preservation method；Control method

稻瘟病是水稻主要病害之一，易造成水稻的大面积减产，它是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae；无性态为稻梨孢菌：Pyricularia oryzae）引起[1]，产生的孢子通过风、雨水、病残体等传播[2]，一旦遇到合适的气候条件，易大面积暴发，造成严重危害。目前，对稻瘟病病菌生理机制的研究需要在室内人工环境中进行培养鉴定。多年来，不同科研工作者对适合稻瘟病菌培养方法及条件等进行了深入研究，得到了大量试验结果。本文根据文献报道以及部分结果实验，对稻瘟病菌产孢技术和防治技术做以下总结概述。

1 稻瘟病菌单孢分离方法

稻瘟病菌分离方法多种多样，主要有直接挑单孢法、罹病组织分离法、稀释法等，但运用最多的还是参照高坂淖尔等[3]提出的挑菌法。分离出单一的稻瘟病菌是培养的关键，为后期回接鉴定提供了基础保障。

1.1 挑菌法 装置的制备：用硬纸制作一个圆形的搁物台（正好可以套在聚光镜镜头上，直径2.3cm，高度2.0cm），在搁物台的上部剪1个小口，可以让稻节固定。在样品夹的右部分粘上1块两面胶，宽度和长度正好可以将1块橡皮固定住，将针灸针末端减去后插在橡皮中部，整个挑菌装置制作完成。具体操作：将采集的病稻节用自来水冲洗干净，然后置于铺有湿润无菌滤纸的培养皿中保湿培养2d左右。将病稻节放在制作的搁物台上，先移动载物台使接种针移到视野中央，通过细准焦螺旋使接种针清晰成像，然后将针灸针移到视野外；接着再用调节旋钮上下调整使稻节上的孢子在目镜中能清晰成像，此时将针灸针慢慢靠近病稻节，在目镜下挑取单孢。最后用接种针取一小块固体培养基蘸取单孢，置于平板中央培养。这种操作过程需在超净工作台中完成。这种方法分离单孢精确，但是操作难度大，需要技巧和熟练，分离效率50%～70%。

1.2 罹病组织分离法[4] 将采集的病稻节先用75%酒精消毒30s后，用自来水冲洗干净，然后按照挑菌法一样保湿培養。培养完成后的病稻节上面产生大量孢子，用无菌镊子夹取病稻节，然后在培养基平板上轻敲3～4下，此时解剖镜下观察单孢的有无及数量。这种分离方法操作简单，但是产生的单孢可能不是同一生理小种，不能分离出纯稻瘟病菌株，对后期的实验结果影响很大。而且这种方法在敲落孢子的过程中污染几率大。

2 稻瘟病菌分离培养基

适合稻瘟病菌生长和产孢的培养基种类丰富，其组成成分也千差万别。在生理小种鉴别试验中，前期需要在实验室培养中筛选合适的培养基使病菌产孢量丰富，而产孢量低且存在其他问题的培养基会被淘汰，筛选最优的产孢培养基是实验的关键。几十年来，不同的研究者报道了许多适合稻瘟病产孢的培养基。

2.1 马铃薯蔗糖培养基[5] 取200g马铃薯加水煮沸30min，用纱布过滤，补水至1000mL，然后加20g蔗糖搅拌均匀，平板培养基再加1%琼脂。这种方法制作方便，成本低廉，产孢量相对适中，实际工作中应用较为广泛。

2.2 番茄燕麦培养基[6] 称取燕麦片40g在水中煮沸10min，用双层纱布过滤，番茄汁150mL，将2种汁液混合，再加水定容到1L，平板培养基再加1%琼脂。这种方法产孢量合适，一般都能达到相应的产孢量，而且成本低，是较为合适的培养基之一。

2.3 米糠培养基[7] 米糠50g在水中煮沸30min，用双层纱布过滤，加入蔗糖25g，再加水定容到1L，平板培养基再加1%琼脂。这种方法较为经典，但是米糠含氮量低，其他营养价值也不高，所以产孢量低。根据许鸣一的研究报道，经改良的3×米糠培养基使产孢量增加，但也存在因透明度低不适合观察等缺点。

2.4 稻杆煎汁V8培养基[3] 将50g稻杆煮沸加水补充至750mL，V8液汁250mL，CaCO3 3g，琼脂10g。这种方法产孢量优于米糠培养基，但经济成本较高，实际生产中不适合使用。

2.5 稻秸浸出液+PDA培养基（1∶1）[8] 稻秸浸出液：称取剪碎的稻秸30g，用1000mL清水浸泡16～24h；PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，清水1000mL。这种方法在经济成本和来源难易程度上优于番茄燕麦培养基，但是制作起来相对复杂一些。在实验过程中，选择什么样的培养基供稻瘟病菌生长和产孢，还应根据实验需要以及材料的方便可取性。

3 稻瘟病菌适宜温度和pH

根据文献报道，28℃最适合稻瘟病菌的生长和产孢，其中16℃下虽能产孢，但病菌生长明显滞后，这可能是由于温度低限制了病菌生长所需的酶活性[9]，但后期恢复28℃，病菌仍能正常产孢。23℃产孢量少于28℃，但多于33℃。38℃病菌无法正常生长，但未完全失去活性[10]。

不同菌株对不同pH的变化反应存在一定的差异，但是在pH5～7的范围内，菌株的生长速率基本不受影响，但就生长状况而言，pH5时病菌生长状况良好[10]。

4 稻瘟病菌保存方法

稻瘟病菌的保存过程至关重要，若保存不佳，容易出现杂菌污染、病菌失去活性等状况，因此选择合适的保存方法是整个实验的重中之重。

4.1 滤纸片保存法[11] 将分离的菌株接种在平铺有10张1cm×1cm无菌滤纸片的平板培养基上，待菌株长满滤纸片，用镊子夹取滤纸片放入无菌离心管中，干燥处理，待滤纸片完全干燥后将离心管盖上盖子放入-20℃冰箱中保存。这种方法操作简单，不易造成污染，保存方便。

4.2 稻草节保存法 将稻节用粉碎机粉碎（粉碎成丝状而非粉末状的程度），置于灭菌锅中121℃、45min灭菌，而后将其平铺在平板培养基上，接种稻瘟病菌，待病菌长满培养皿，将稻节转移至离心管中，干燥处理后于-20℃冰箱中保存。这种方法的材料来源虽是病菌的寄主植物，但是后期培养易造成污染，稻节含有其他杂菌，保存难度大。

4.3 高粱粒保存法[11] 高粱粒在121℃、45min灭菌后烘干，取10粒平放在平板培养皿中部，接种稻瘟病菌，直至病菌长满高粱粒，然后将高粱粒转入离心管中，干燥后盖上盖子保存在-20℃冰箱中。这种方法容易造成其他杂菌的滋生，占用空间大。

5 稻瘟病防治技术

在稻瘟病易发区，其预防和防治工作每年必不可少，做好预报和预警以及防控，可以大大降低稻瘟病发生带来的风险。

5.1 积极宣传，加强农户的防范意识[12] 在水稻种植区，要经常培训，发放植保有关资料，提高农民的防范意识和技术水平，一旦发现病情要及时上报，将风险降到最低。

5.2 选用抗病品种[13] 随着抗稻瘟病品种的普及与推广，种植抗病品种是最佳选择。但是应杜绝长时间种植单一品种，使优势生理小种大面积扩散，造成不可挽回的损失，所以要搭配使用抗病品种。

5.3 加强水肥管理[14] 在水稻种植前期，及时清理杂草、病稻节等，在水稻生长期，合理施肥，多施农家肥，避免施单一肥；合理灌溉，确保水稻生长。

5.4 化学防治[15] 在稻瘟病发生的情况下，及时选择合适的药剂进行喷药防治，并避免使用单一药剂，延缓抗药性的产生。药剂防治要避开水稻扬花期。

5.5 生物防治 随着科学技术的进步，利用生物技术防治稻瘟病已屡见不鲜。研究表明，芽孢杆菌对防治稻瘟病中具有重要的作用[16]；布氏白僵菌对稻瘟病菌防治具有一定的抑制作用[17]；解淀粉芽孢杆菌发酵滤液能明显抑制稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发[18]；瑞香狼毒乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌有较强的抑制作用，它能抑制菌丝生长、孢子萌发和生长[19]；黄绿木霉菌发酵液对稻瘟病菌有抑菌和致菌死亡的作用[20]；灰黄霉素对稻瘟病菌的抑制效果与其浓度成正比[21]等。在生物防治稻瘟病的研究方面已经取得一定的进展，但是在实际生产应用中还有待加强和推广。

6 小结与展望

水稻是我国最主要的粮食作物之一，但稻瘟病菌每年都会对其造成严重危害。稻瘟病菌生理小种繁多且易变异对其研究需先了解其产孢特点及生物学特性，掌握治病机理。在此基础上，坚持绿色防治理念，通过科学的方法降低稻瘟病的发生几率，确保水稻生产安全。

参考文献

[1]杨勤忠，林菲，冯淑杰，等.水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究进展[J].中国农业科学，2009，42（5）：1601-1615.

[2]苏柳.稻瘟病菌的致病性分析及水稻抗稻瘟病基因的定位[D].南昌：南昌大学，2016.

[3]高坂卓尔，山崎义人.稻瘟病和抗病育种[M].长春：东北师范大学出版社，1986：114-121.

[4]金晓春，李志新，张海生，等.稻瘟病菌分离及保存方法研究[J].安徽农业科学，2008，36（17）：7308，7390.

[5]兰波，李湘民，杨迎青，等.稻瘟病菌产孢技术研究[J].江西农业学报，2012，24（2）：74-76.

[6]张国珍，马秋娟，彭友良.水稻稻瘟病菌有性世代形成条件的优化[J].植物病理学报，2002，32（2）：121-126.

[7]阮洪椿，黄永康，陈如福，等.稻瘟病菌培养基筛选试验[J].福建稻麦科技，2004，22（1）：31-32.

[8]吴斯骏，孙强，陈洪凡，等.一种稻瘟病菌培养产孢培养基的配制与效比分析[J].安徽农业科学，2018，46（18）：118-120.

[9]唐力琼，张玲，胡运高，等.稻瘟病菌生物学特性及产孢条件研究[J].河南农业科学，2012，41（6）：97-100.

[10]许鸣一.稻瘟病菌四种生理小种的形态和生长特性研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2011.

[11]赵沙沙，田永宏，余华强，等.稻瘟病菌孢子的分离和保存方法[J].湖北农业科学，2015，54（24）：6252-6254.

[12]高云，颜培玲，宋小娟，等.水稻稻瘟病研究进展[J].安徽农学通报，2018，24（8）：62-65.

[13]华丽霞，何炼，蒋秋平，等.稻瘟病抗性基因特异性分子标记的开发及应用进展[J].分子植物育种，2016，14（10）：2739-2748.

[14]黄昆，戴世常.水稻稻瘟病发生情况及综合防治现状[J].农业与技术，2018，38（8）：27，82.

[15]杜宜新，李科，阮宏椿，等.稻瘟病菌对稻瘟灵、异稻瘟净和三环唑的敏感性[J].植物保护学报，2011，38（5）：455-460.

[16]沙月霞.防治稻瘟病芽孢杆菌的筛选及生防机制研究[D].北京：中国农业大学，2016.

[17]何超.布氏白僵菌和黄绿僵菌对几种植物病原菌的拮抗作用研究[D].合肥：安徽农业大学，2015.

[18]王玉双，肖蓉，郭照辉，等.来源于中药的稻瘟病菌拮抗解淀粉芽孢杆菌鉴定及其活性成分特性[J].中国生物防治学报，2018，34（5）：746-752.

[19]梁海英.瑞香狼毒对稻瘟病菌的抑制活性及其机理的初步研究[D].成都：四川大学，2007.

[20]林志伟，孙冬梅.黄绿木霉菌發酵液对稻瘟病菌的影响[J].贵州农业科学，2015，43（3）：180-182.

[21]张传能，黄铭杰，毛宁.灰黄霉素对水稻稻瘟病菌的防治效果研究[J].中国农学通报，2015，31（4）：190-194.

（责编：张宏民）