灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌(TPL04)代谢产物的研究

李 叶，刘 胜，张 凯，张 瑶，李有志,2，丁文兵,2 *

1湖南农业大学植物保护学院；2国家植物功能成分利用工程技术研究中心，长沙 410128

淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)是一种内寄生性真菌，最早分离于秘鲁根结线虫卵囊，分布世界各地，且寄主广泛、培养简单[1]。淡紫拟青霉菌在防治植物病原线虫效果显著，目前活菌体已投入生产使用；可侵染半翅目、同翅目、鳞翅目害虫；在防治植物病原菌方面也有良好效果；还能产生类生长素促进植物生长；对难溶磷酸盐类农药也有降解作用[2]。本实验室前期已对灰毛豆内生真菌进行系统地分离鉴定[3]，而其中的活性菌株TPL04鉴定为淡紫拟青霉菌(P.lilacinum)。虽然淡紫拟青霉对生长条件要求较低，但不同的寄主来源会使其次生代谢物发生较大变化。如土壤及多种植物根系来源的菌株已阐明的主要化合物类型有：甾体、脂肪酸、酚酸、倍半萜、吲哚乙酸类似物等[4,5]；而来自海洋环境的菌株则还能产鞘氨醇类、甘油酯类、吡喃酮类、环己稀酮类等化合物[6]。鉴于本研究中的菌株TPL04来自灰毛豆叶片，其次生代谢产物尚不清楚。本文对该内生菌株(TPL04)进行液体发酵，对其发酵产物化学成分进行分离、鉴定及单体化合物抑菌活性测定。共分离得到8个单体化合物，结构分别鉴定为5-羟基己酸-4-内酯(1)、(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮(2)、2′-脱氧胸苷(3)、对羟基苯甲酸甲酯(4)、光色素(5)、β-胡萝卜苷(6)、尿嘧啶核苷(7)、己六醇(8)，其中化合物4对四种植物病原菌的生长有抑制活性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

洁净工作台(SW-CJ-1BU，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；高压灭菌锅 (TOMY SX-500，上海田源技术有限公司)；恒温培养振荡器(HNY-211C，天津市欧诺仪器仪表有限公司)；光照培养箱(GZX-250BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司)；旋转蒸发仪(EYEL4N-1001，上海爱朗仪器有限公司)；薄层层析硅胶(烟台江友硅胶开发有限)；玻璃点样毛细管(华西医科大学仪器厂生产)；万用电炉(北京科伟永兴仪器有限公司生产)；三用紫外线分析仪(ZF-6，上海嘉鹏科技有限公司)；正相柱层析硅胶：200-300目硅胶、拌样硅胶：60-100目硅胶(青岛海洋化工有限公司)；数控超声波清洗器(KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；拌样反相硅胶(ODS C18，日本Nomura公司)；半制备型高压输液泵[SP-5030，赛谱锐思(北京)]；高效液相色谱仪(HPLC)：Waters 1525串2414检测器(美国Waters 公司)，半制备型色谱柱型号YMC-Pack ODS-A(日本岛津公司，250 mm × 10 mm I.D.;S-5 μm,12 nm)；超纯水(Mill-Q超纯水机制)；Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶(瑞士Amersham生物科学公司)；自动部分收集器(BS-100N，上海沪西分析仪器有限公司)；厚制备板(烟台江友硅胶开发有限公司)；有机试剂：甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯(天津恒兴化学试剂制造有限公司生产)。

1.2 培养基

固体培养基为PDA培养基(取去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g，用蒸馏水定容至1 000 mL)；液体培养基为PDB培养基(取去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 000 mL)[7]。以上培养基需在121 ℃、高压灭菌20 min，待降温降压后取出。

1.3 菌株

菌株TPL04源于实验室前期成果，分离自灰毛豆叶片，经过生态学和形态学鉴定后，确定其为淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)[3]现保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2017408。

2 实验方法

2.1 菌株的发酵及其次生代谢产物的提取

菌株液体发酵条件：将斜面保藏的菌株转接至马铃薯-琼脂(PDA)平板上进行活化，26 ℃培养5～7天后接种至装有200 mL马铃薯液体(PDB)培养基的500 mL锥形瓶中，温度为28 ℃，转速为12 000 rpm，发酵周期为7～10天，共收集100 L发酵液。

发酵结束后，用8层纱布过滤，滤液用乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3遍，经旋转蒸发仪旋干后得粗提物；菌丝用甲醇提取3遍，经减压蒸干后得粗提物，合并三种粗提物得总浸膏48.4 g。

2.2 分离

取上述浸膏45 g，用60～100目硅胶拌样，经正相硅胶柱(200～300目)采用石油醚/丙酮(9∶1、8∶2、7∶3，v/v)和氯仿/甲醇(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4，v/v)，依次梯度洗脱后经TLC检测合并得4个主流份(Fr.A1～A4)。A1(共169 mg)经凝胶Sephadex LH-20柱层析，以甲醇洗脱得Fr.A1-1，经制备薄层色谱法，以石油醚/丙酮(7∶3)为展开剂得Fr.A1-1-1，通过HPLC制备，甲醇/水(50∶50，v/v)洗脱，流速为3 mL/min，得到化合物1(2.6 mg，Rt=13.5 min)和2(10.5 mg，Rt=18.0 min)。将Fr.A2(1.74 g)采用ODS C18柱层析法，以甲醇/水(30%→90%，v/v)洗脱，经TLC检测合并得4个亚组份Fr.A2-(1～4)；Fr.A2-1 经凝胶Sephadex LH-20柱层析，以甲醇洗脱得Fr.A2-1-1，经制备薄层色谱法，以氯仿/甲醇/水(7∶3∶1)为展开剂得Fr.A2-1-1-1，通过HPLC制备，甲醇/水(30∶70，v/v)洗脱，流速为3 mL/min，得到化合物3(4.5 mg，Rt=21.4 min)；Fr.A2-2，经制备薄层色谱法，以氯仿/甲醇(9∶1)为展开剂得Fr.A2-2-2，通过HPLC制备，甲醇/水(50∶50，v/v)洗脱，流速为3 mL/min，得到化合物4(1.3 mg，Rt=28.7 min)；Fr.A2-3中有较纯的主点，沉淀用纯甲醇清洗，得化合物5(0.9 mg)，为淡黄色粉末；Fr.A2-4为白色沉淀，通过纯甲醇清洗得化合物6(2.9 mg)。Fr.A3(0.78 g)经凝胶Sephadex LH-20柱层析，以甲醇洗脱得Fr.A3-1，经制备薄层色谱法，以氯仿/甲醇/水(7∶3∶1)为展开剂得化合物7(16.1 mg)。Fr.A4(4.84 g)采用ODS C18柱层析法，以甲醇/水(30%→90%，v/v)洗脱，得Fr.A4-1，重结晶(甲醇/水)得白色针状晶体8(12.2 mg)。

2.3 单体化合物的抑菌活性测定

采用含毒介质法[8]。

毒培养基的制备：称取所需样品量，溶解于甲醇，加入吐温80乳化后，用无菌水配制成所需浓度的药液；PDA冷却至50～60 ℃，在无菌条件下，将药液与培养基以1∶9混合，得到含毒培养基。

将约7 mm的病原真菌菌饼接至含毒培养基和溶剂对照培养基上，设3个重复，5个浓度梯度。观察菌落生长情况，测量菌落直径，以M=(A-C)/A×100%(M为抑菌率，A为对照组的菌落直径，C为处理组的菌落直径)求出抑菌率，用SPSS软件算出对应的线性回归方程和EC50。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1棕色油状，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:4.38 (1H,m,H-4),3.92 (1H,m,H-5),2.52 (2H,t,J=8.0 Hz,H-2),2.19 (2H,m,H-3),1.14 (3H,d,J=6.5 Hz,H-6)；13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:180.5 (s,C-1),85.7 (d,C-4),68.9 (d,C-5),29.5 (t,C-2),22.8 (t,C-3),18.8 (q,C-6)；ESI-MSm/z153 [M+Na]+,283 [2M+Na]+,295 [2M+Cl]-。以上数据与文献[9]数据比对基本一致，故鉴定该化合物为5-羟基己酸-4-内酯(5-Hydroxyhexan-4-olide)。

化合物3白色晶体，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.79 (1H,d,J=0.9 Hz,H-6),6.25 (1H,t,J=6.8 Hz,H-1′),4.38 (1H,m,H-3′),3.88 (1H,m,H-4′),3.77 (1H,dd,J=12.0,3.2 Hz,H-5a′),3.70 (1H,dd,J=12.0,3.6 Hz,H-5b′),2.20 (2H,m,H-2′),1.85 (3H,s,CH3-5)；13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:166.6 (s,C-2),152.6 (s,C-4),138.3 (d,C-6),111.7 (s,C-5),89.0 (d,C-4′),86.4 (d,C-1′),72.4 (d,C-3′),63.0 (t,C-5′),41.3 (t,C-2′),12.6 (q,5-Me)；ESI-MS m/z 265 [M+Na]+,241 [M-H]-,277 [M+Cl]-。结合文献[11]确定化合物3为2′-脱氧胸苷 (2′-Deoxythymidine)。

化合物4白色固体粉末，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,DMSO)δ:7.83 (2H,d,J=8.8 Hz,H-2,H-6),6.79 (2H,d,J=8.8 Hz,H-3,H-5),3.82 (3H,s,OCH3);13C NMR (150 MHz,DMSO)δ:168.9 (s,C-7),163.9 (s,C-4),132.9 (d,C-2,5),122.2 (s,C-1),116.4 (d,C-3,6),52.4 (q,OCH3)；ESI-MSm/z305 [2M+H]+,151 [M-H]-,187 [M+Cl]-。以上数据与文献[12]报道数据一致，故此鉴定为对羟基苯甲酸甲酯 (Methylparaben)。

化合物5黄色固体粉末，溶于DMSO；1H NMR (600 MHz,DMSO)δ:11.84 (1H,s,NH-3),11.67 (1H,s,NH-1),7.91 (1H,s,H-6),7.71 (1H,s,H-9),2.48 (3H,s,H-12),2.46 (3H,s,H-11)；13C NMR (150 MHz,DMSO)δ:160.6 (s,C-4),150.0 (s,C-2),146.4 (s,C-10a),144.6 (s,C-7),141.6 (s,C-9a),138.8 (s,C-8),138.3 (s,C-5a),130.2 (s,C-4a),128.7 (d,C-6),125.8 (d,C-9),20.2 (q,C-12),19.5 (q,C-11)；ESI-MSm/z256 [M+Na]+,241 [M-H]-,277 [M+Cl]-。以上数据与文献[13]报道数据对照基本一致，故此鉴定为光色素 (Lumichrome)。

化合物6白色粉末(氯仿/甲醇)，溶于吡啶；无紫外吸收，碘氧化显色，5% 硫酸-乙醇喷雾加热显色紫红色；氯仿-甲醇9∶1展开Rf=0.5，其与β-胡萝卜苷对照品对照，经3种溶剂系统展开后，在同Rf值处有同样紫色斑点，混合点样后展开为单一斑点；熔点mp：295～296 ℃，与对照品混合后测熔点不下降，鉴定化合物为β-胡萝卜苷 (β-Daucosterin)。

化合物7黄色油膏状物，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.99 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),5.88 (1H,d,J=4.7 Hz,H-1′),5.68 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.15 (1H,m,H-3′),4.13 (1H,m,H-2′),3.99 (1H,m,H-4′),3.82 (1H,dd,J=12.2,2.7 Hz,H-5b′),3.71 (1H,dd,J=12.2,3.1 Hz,H-5a′)；13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:166.3 (s,C-4),152.6 (s,C-2),142.9 (d,C-6),102.8 (d,C-5),90.9 (d,C-1′),86.5 (d,C-4′),75.9 (d,C-3′),71.5 (d,C-2′),62.4 (t,C-5′)。以上结果并结合文献[14]确定此化合物为尿嘧啶核苷 (Uridine)。

化合物8白色针状晶体，易溶于水，微溶于氯仿甲醇混合溶剂；1H NMR (600 MHz,D2O)δ:3.74 (2H,dd,J=11.8,2.8 Hz,H-1a,H-6a),3.67 (2H,d,J=8.6 Hz,H-3,H-4),3.62 (2H,m,H-2,H-5) 3.54 (2H,dd,J=11.8,6.2 Hz,H-1b,H-6b)；13C NMR (150 MHz,D2O)δ:70.8 (d,C-2,5),69.2 (d,C-3,4),63.2 (t,C-1,6)；ESI-MSm/z205 [M+Na]+,181 [M-H]-。以上数据与文献[15]比对基本一致，故化合物鉴定为己六醇 (Hexitol)。

图1 化合物1～8的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-8

3.2 抑菌活性

设置化合物处理浓度为400 mg/L时，仅化合物4表现出对四种植物病原菌：水稻纹枯菌(Pelliculariasasakii)、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、草莓灰霉菌(Botrytiscinerea)、油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)有较强的抑制活性，其抑制率分别为100%、100%、100%、94.12%。重新设置浓度梯度后，根据结果算出抑菌率，并将数据输入SPSS软件中，求出线性回归方程和对应的EC50为54.619、78.084、109.315、179.548 mg/L，结果如表1所示。

表1 化合物4对四种植物病原菌的抑制活性

注：EC50的单位为mg/L。

Note:EC50in mg/L.

4 讨论

植物内生真菌(endophytic fungus)存在于植物根、茎、叶等组织器官中，通常能与植物保持共生关系，参与并影响寄主植物代谢产物的种类或含量，少数还能产生相同或类似的化合物[16]。本文从灰毛豆叶片内生真菌TPL04发酵产物中分离鉴定了8个化合物，其中化合物2与灰毛豆叶片中的成分(S)-4-苄基-2-噁唑烷酮互为构型异构体[17]，表明菌株TPL04与寄主植物灰毛豆在次生代谢产物的合成方面存在一定的联系。淡紫拟青霉菌(Purureocilliumlilacinum)还是重要的生防杀菌剂，已有研究表明其发酵液能抑制玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctomiasolani)等植物病原菌生长[18]；淡紫拟青霉菌中的多糖及蛋白性质抗生素对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)有显著拮抗作用，能抑制尖孢镰刀菌孢子的生成、萌发与菌落生长[19]。本研究进一步发现该菌株的次生代谢成分对羟基苯甲酸甲酯(4)对水稻纹枯菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、油菜菌核菌有抑菌活性，为淡紫拟青霉菌的开发利用奠定了化学物质基础。