荔枝DA1同源基因的克隆及生物信息学分析

王 弋，董 晨，魏永赞，郑雪文，李伟才

(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，农业部热带果树生物学重点实验室，广东 湛江 524091)

【研究意义】荔枝起源于我国，是岭南地区的特色水果，因其甜美的风味和丰富的营养深受消费者的欢迎。但是大部分荔枝品种果核大，影响食用口感及商品价值。‘妃子笑’是目前产量最大的荔枝品种，具有果大核小的优点，因此对‘妃子笑’果核发育相关的基因进行分析，有助于理解荔枝果核发育的分子机制，为今后利用生物技术定向改良果核性状提供基因资源。【前人的研究进展】利用分子生物学及遗传学的方法，科学家已在拟南芥和水稻等植物中鉴定了多个调控种子大小的基因如DA1，GS3，GW7，DEP1等[1-4]。其中DA1是一个重要的种子大小调控基因，该基因编码一泛素受体。拟南芥中的研究发现，该基因突变后种子和器官大小显著增加，细胞学观察结果发现DA1通过抑制珠被细胞的增殖控制种子大小[5]。蛋白序列分析表明，DA1蛋白具有两个泛素受体典型的ubiquitin interaction motifs (UIM)和一个single zinc-binding(LIM)结构域。生化实验表明，DA1蛋白与E3连接酶DA2存在直接的蛋白互作，推测DA1通过DA2识别并降解特异底物。此外，DA1与UBP15也存在直接的相互作用，并且通过影响其蛋白稳定性调控种子大小[5]。DA1不仅影响种子大小，调控该基因的表达水平还能够提高作物产量。在油菜中，下调DA1同源基因BnDA1的表达能够显著增加种子大小，提高种子产量及生物量[6]；而在玉米中，通过上调突变形式DA1的表达水平也可增加产量并增强淀粉的合成[7]。这表明DA1在作物生产中具有重要的利用价值，但目前该基因在荔枝中并未见报道。【本研究切入点】根据前期RNA-seq数据，预测荔枝DA1的同源基因。利用生物信息学软件分析3个基因及其编码蛋白的序列特征。【拟解决的关键问题】分析荔枝DA1蛋白的保守结构域及其进化关系，为进一步研究荔枝DA1基因的生物学功能提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以荔枝种质资源圃种植的16年树龄、树势较壮的‘妃子笑’荔枝结果树为实验母树。取雌花谢花后50 d果实中的果核为实验材料，果核以液氮处理，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 基因序列的获得

根据前期RNA-seq数据，分析鉴定荔枝LcDA1基因转录本，利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)的Open Reading Frame Finder在线软件分析荔枝LcDA1的开放阅读框[1]。

1.3 蛋白理化性质分析

利用ProtParam网站(http://web.expasy.org/protparam/)，对荔枝DA1蛋白的相对分子量、氨基酸数量及理论等电点等理化性质进行分析。

1.4 蛋白质二级结构预测

蛋白二级结构利用PredictProtein (https://www.predictprotein.org/)在线平台进行分析。

1.5 结构域分析

使用EBI数据库的interProScan功能(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)对荔枝LcDA1蛋白保守结构域进行分析。

1.6 进化树分析

利用AlignX软件对利荔枝LcDA1蛋白以及来自油菜、拟南芥、玉米等物种的DA1蛋白进行多重序列比对，并利用MEGA 6.06软件的neighbor-joining工具进行系统进化树的构建。

2 结果与分析

2.1 荔枝LcDA1基因的鉴定及序列分析

根据前期RNA-seq数据，对拟南芥DA1的同源基因进行进行鉴定，并在种子cDNA中进行扩增。鉴定到3个荔枝DA1同源基因，分别命名为LcDA1-1，LcDA1-2和LcDA1-3。3个基因转录本长度分别3039、2525和2187 bp，ORF长度分别为1419、1479和1104 bp。3个荔枝DA1同源基因的信息列于表1。

2.2 荔枝LcDA1蛋白理化性质分析

利用ProtParam网站，对3个荔枝LcDA1的理化性质进行分析。结果显示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3蛋白分子式分别为C2347H3606N670O709S36、C2436H3775N683O773S33和C1807H2756N514O553S32，相对分子量分别为53706.67、56055.86和41554.79，理论等电点分别为5.89、5.16和6.46，不稳定系数分别为68.83、69.84和56.10(表2)。

2.3 荔枝LcDA1基因与DA1的序列相似性比较

利用Vector NTI软件的Alignx工具，对荔枝LcDA1-1，LcDA1-2和LcDA1-3基因及拟南芥DA1基因碱基及氨基酸序列进行比对，分析不同DA1基因及编码蛋白之间的相似性。结果显示在碱基和蛋白水平LcDA1-1和LcDA1-2具有较高的相似性，而与LcDA1-3的相似性较差(表3)。这与LcDA1-3在C末端较LcDA1-1和LcDA1-2缺少100多个蛋白相关。

表1 荔枝LcDA1基因的基本特征

表2 LcDA1蛋白理化性质分析

表3 荔枝LcDA1与拟南芥DA1基因及编码蛋白相似性分析

2.4 荔枝LcDA1基因保守结构域分析

为了分析LcDA1的蛋白结构，利用EBI数据库的interProScan功能对LcDA1蛋白的结构域进行分析。结果显示在LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3蛋白均具有LIM-type锌指结构域[8-9]；LcDA1-1、LcDA1-2还有2个与泛素互作的基序UIM1和UIM2[10]。这些保守基序及结构域暗示LcDA1蛋白具有与DA1蛋白相同的功能(图1)。

2.5 荔枝LcDA1二级结构分析

利用predictprotein对LcDA1的二级结构进行预测。结果显示LcDA1-1由27.54 %的α-螺旋，8.69 %的β折叠及63.70 %的无规则卷曲组成；LcDA1-2由28.05 %的α-螺旋，6.10 %的β折叠及65.85 %的无规则卷曲组成；LcDA1-3由16.08 %的α-螺旋，7.36 %的β折叠及76.57 %的无规则卷曲组成(表4)。

2.6 荔枝LcDA1进化树分析

将拟南芥DA1蛋白序列在NCBI中进行Blast检索，获得多个物种的DA1同源蛋白序列并下载(图2)。物种包括水稻(Oryzasativa)，醉蝶花(Tarenayahassleriana)，月季(Rosachinensis)，萝卜(Raphanussativus)，桃(Prunuspersica)，梅(Prunusmume)，樱桃(Prunusavium)，毛果杨(Populustrichocarpa)，桑树(Morus notabilis)，木薯(Manihotesculenta)，锦葵(Herraniaumbratica)，棉花(Gossypiumhirsutum)，野草莓(Fragariavesca)，山萮菜(Eutremasalsugineum)，桉树(Eucalyptusgrandis)，番木瓜(Caricapapaya)，甘蓝(Brassicaoleracea)，油菜(Brassicanapus)。不同物种中的DA1同源蛋白序列以MEGA 6.06软件进行分析，并构建系统进化树。结果显示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3分别于不同的植物聚类在一起，其中LcDA1-1与番木瓜的进化关系最近，LcDA1-2和LcDA1-3与水稻的进化关系最近。

图1 LcDA1蛋白保守结构域分析Fig.1 Conserved domains of LcDA1 protein

表4 蛋白二级结构

3 讨 论

DA1编码一类泛素受体蛋白，受体蛋白既能够识别游离泛素，也能够识别被泛素化的底物[11-12]，拟南芥中的研究发现该基因参与调控植物种子大小。拟南芥DA1蛋白编码532个氨基酸，包含2个泛素作用结构域(UIM)和1个锌指结构域(LIM)。在育种中DA1也表现出很好的应用潜力，有研究表明调控油菜和玉米中通过调控DA1同源基因的表达水平可显著增加产量和生物量[6-7]。

本研究在荔枝中鉴定到3个DA1同源基因(LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3)，基因编码蛋白长度分别为473、493和368个氨基酸。生物信息分析表明LcDA1-1、LcDA1-2编码蛋白与拟南芥DA1蛋白的相似性达到58.6 %和53.0 %。而LcDA1-3与拟南芥DA1相似性偏低，仅有27.9 %，这与LcDA1-3相比拟南芥DA1缺少164个氨基酸相关。虽然蛋白相似性并不是非常高，但LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3均具有典型的LIM结构域，而LcDA1-1和LcDA1-2还具有UIM结构域，这表明LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3确为拟南芥DA1的同源基因。UIM是泛素受体重要的保守结构域，其能够作为接头与泛素化底物相互作用，并将底物引导至降解的位置。生化实验发现，UIM中的UIM2负责与泛素和E3泛素连接酶结合[13]。LIM也是一类保守的结构域，其包含锌指串联结构域，为特异的蛋白互作提供平台[14-15]。LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3基因编码蛋白中关键结构域的保守性也表明其在进化中受到严格的选择，也暗示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3具有与拟南芥DA1蛋白类似的生物学功能。

图2 荔枝和21种植物LcDA1蛋白系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of LcDA1 protein in litchi and 20 other plants

进化树分析表明，LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3并未聚类在一起，而是分别与不同植物的DA1蛋白聚类在一起，这表明LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3已经出现了一定的分化。LcDA1-1与来自热带果树番木瓜的进化关系最近，LcDA1-2和LcDA1-3与水稻的OsDA1聚类在一起。

4 结 论

本研究利用转录组测序数据，在荔枝中鉴定了3个DA1同源基因的全长序列。生物信息学分析结果显示3个基因的编码蛋白均含有DA1蛋白典型的LIM结构域，暗示LcDA1-1、LcDA1-2和LcDA1-3具有保守的蛋白功能。本研究为利用DA1基因调控荔枝种子大小，从而改善荔枝果实品质改良提供了重要基因资源。