玉米蔗糖合成酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

2019-04-27赵秋芳陈宏良

西南农业学报 2019年11期

陈曙，赵秋芳，陈宏良，金辉*

(1.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江 524091；2.农业部热带果树生物学重点实验室，广东湛江 524091)

【研究意义】蔗糖作为高等植物光合作用的主要产物，其本身不能被直接利用，需被分解成可溶性糖才能参与植物的各项生理代谢活动[1]。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase，SUS)是植物糖代谢的关键酶之一，与植物细胞组织和骨架的构建、植株的生长发育和果实的成熟以及植物对逆境胁迫的响应等方面密切相关[2]。因此鉴定和研究植物蔗糖合成酶基因家族对深入了解植物的生长发育规律、提高作物抗逆性等方面都有重要意义。【前人研究进展】研究表明，植物蔗糖合成酶家族是一个小基因家族，所含基因数量不多，但不同植物中基因成员数差别较大。在柑橘中鉴定出3个SUS基因[3]，水稻、拟南芥和橡树中均发现6个SUS基因[4-6]，大豆中鉴定出12个SUS基因[7]，以及谷子和葡萄中分别鉴定出9和5个SUS基因[8-9]。所有SUS蛋白序列高度保守，均含有蔗糖合成结构域以及糖基转移酶结构域。基因表达研究发现，SUS家族成员具有组织表达特异性。在柑橘中，CitSUSA在柑橘的果实发育过程阶段其表达水平呈上升趋势，而CitSUS1则表现为下降趋势，这表明CitSUSA与CitSUS1具有不同的表达模式[3]。在大豆中，对蔗糖合成酶突变体植株的研究发现SUS酶活性降低会导致根部中根瘤菌固氮能力减弱，部分组织器官发生退化，植株抗逆能力变差等现象[7]。同样研究发现，SoSUS1在甘蔗的叶片、叶鞘以及茎中均有表达，但在茎中的表达量远高于其他部位，说明甘蔗茎中的含糖量高于其他部位[10]。SUS家族成员除了具有组织特性，参与植物的生长发育过程外，还与植物对逆境胁迫的应答等方面有关。吕金印等[11]通过对生育后期的不同小麦品种进行干旱处理，发现抗旱品种长武134的蔗糖合成酶活性显著高于敏感品种郑引1号，且旗叶中的蔗糖和淀粉积累速率明显高于后者，表明植物蔗糖合成酶可能参与了植物的抗旱过程。王旭明等[12]在孕穗期对水稻进行盐胁迫处理，结果显示在轻度盐胁迫下水稻叶片中蔗糖合成酶(SS)活性增强，蔗糖和淀粉的积累量增加，植物抗逆性得到加强；但随着盐浓度的增大，SS活性明显降低，蔗糖合成速率降低，植株生长表现出明显的抑制现象。覃鸿妮等[13]通过对几种类型玉米品种进行不同的种植密度模式试验，结果显示种植密度对蔗糖含量和蔗糖合成酶的活性影响较大，高密度的种植方式不利于叶片中蔗糖的积累。李晓旭等[14]对发菜进行干旱处理，发现在干旱胁迫下SUS2的转录水平和表达量都明显提升，检测发现叶片中蔗糖积累量增加。这些研究表明，植物蔗糖合成酶基因家族成员在植物的生长发育以及抗逆境胁迫过程中有着重要的作用。玉米是我国主要粮食作物之一，提高玉米的品质和产量一直是研究工作的热点。研究表明，蔗糖合成酶对于植物光合作用中蔗糖的合成和分解、产物的转运以及细胞组织的构建等方面都有着重要作用[15]。【本研究切入点】随着植物基因组测序技术的发展，目前已完成了对拟南芥[5]、水稻[4]、大豆[7]和谷子[8]等作物中SUS家族基因成员的全基因组的鉴定和功能分析工作，但对于玉米SUS基因家族的研究尚不多见。【拟解决的关键问题】本研究基于已公布的玉米全基因组测序数据(B73)，利用生物信息学对玉米SUS基因家族进行鉴定，并通过生物学软件对鉴定的玉米SUS基因进行序列特征、理化性质、进化关系等全方面分析，为后续对玉米SUS家族基因功能的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 玉米SUS基因家族成员的鉴定

根据已发表的6个拟南芥蔗糖合成酶基因，在拟南芥数据库(http://www.arabidopsis.org)中搜索并下载相关AtSUS基因信息(AtSUS1-AtSUS6)，其基因序列号分别为AT5G20830、AT5G49190、AT4G02280、AT3G43190、AT5G37180、AT1G73370。以拟南芥蛋白序列为查询序列，从Ensembl Plants基因组数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)中进行本地Blastp比对搜索，查找出玉米基因组中所有候选的SUS基因，所得结果利用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)和PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/)在线软件进行基因结构分析，剔除无典型蔗糖合成酶结构域和糖基转移酶结构域的基因序列，最后得到的基因即为玉米SUS基因家族成员。

1.2 蛋白的氨基酸序列属性分析

利用ExPASy Proteomics Server(http://www.expasy.org/ proteomics )对玉米SUS家族成员进行蛋白分子量、等电点、不稳定系数等理化性质分析预测。使用Plant-mPLocServer(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)在线工具预测玉米SUS蛋白的亚细胞定位。采用bioedit7.0软件进行氨基酸序列相似性分析。

1.3 基因结构示意图的绘制

根据已获得的玉米SUS家族基因成员的基因组序列和CDS序列，利用在线工具GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)分析基因结构，明确内含子和外显子的组成，绘制基因结构示意图。

1.4 系统发育树的构建

在NCBI网站上搜索已公布的拟南芥、水稻SUS家族蛋白成员序列信息，利用ClustalW程序对玉米、拟南芥、水稻基因组中所有SUS蛋白序列进行比对，结合序列比对结果，利用MEGA6软件采用邻接法(neighbor joining，NJ)构建系统发育进化树。参数设置：替换模型设置为“Poisson model”，缺口设置为“Pairwise deletion”,校验参数Bootstrap method 取值为1000。

1.5 玉米SUS基因启动子分析

利用在线工具Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析玉米SUS 家族基因上游1500 bp序列，预测SUS基因基序类别和功能特征。

1.6 玉米SUS家族基因组织表达特性分析

玉米SUS基因家族成员在胚、胚乳、花粉、根、芽、花丝、雄蕊组织中的表达数据下载自Ensemblplants网站(http://plants.ensembl.org/index.html)。利用百迈客云平台的在线绘图工具(http://console.biocloud.net/static/index.html)绘制热图。

2 结果与分析

2.1 玉米SUS基因家族成员的鉴定

根据Blastp比对结果，最终在Ensembl Plants的玉米数据库中得到5个SUS基因(表1),笔者将这5个基因命名为ZmSUS1～ZmSUS5。ZmSUS1和ZmSUS2定位在1号染色体上，ZmSUS5定位在4号染色体上，ZmSUS3和ZmSUS4则在9号染色体上。5个玉米SUS基因其氨基酸数量、CDS长度以及分子量都较为接近，大小和长度分别在802aa(ZmSUS3)～849aa(ZmSUS5)、2409 bp(ZmSUS3)～2550 bp(ZmSUS5)以及91.73KD(ZmSUS3)～96.27KD(ZmSUS5)之间变化。蛋白等电点范围为6.03(ZmSUS4)～7.63(ZmSUS5)，ZmSUS1～ZmSUS4等电点均小于7，蛋白为弱酸性蛋白，ZmSUS5大于7，蛋白为碱性蛋白。

2.2 玉米SUS家族成员的蛋白序列分析

氨基酸序列相似性分析发现，玉米SUS蛋白成员的氨基酸序列相似程度较高(表2)，在51.31 %～97.81 %，其中ZmSUS1与ZmSUS2相似度最高(97.81 %)，其次为ZmSUS3～ZmSUS4(80.52 %)，相似度最低的为ZmSUS4和ZmSUS5，相似度为51.31 %。对玉米SUS蛋白家族成员进行蛋白序列属性分析(表3)，结果显示玉米SUS蛋白结构由α-螺旋、β-转折、扩展链以及无规则卷曲组成，其中α-螺旋所占比例最高，所占比百分比范围为51.94 %(ZmSUS5)～55.51 %(ZmSUS4)，β-转折所占比例最小，仅为6.55 %(ZmSUS1)～6.98 %(ZmSUS3)。蛋白稳定性分析发现，ZmSUS1～ZmSUS4不稳定系数均小于40，鉴定为稳定蛋白，ZmSUS5不稳定系数大于40，属于不稳定蛋白。蛋白亲水性预测结果显示ZmSUS1～ZmSUS5均为疏水性蛋白。对玉米SUS家族蛋白成员进行亚细胞定位预测，结果显示所有蛋白均定位在叶绿体。

表1 玉米SUS家族基因信息

表2 玉米SUS蛋白成员氨基酸序列相似性分析

表3 玉米SUS家族成员蛋白序列分析

2.3 玉米SUS家族成员基因结构分析

前人研究表明，植物中不同物种间的SUS基因结构以及内含子和外显子数目具有高度保守性[15]。本研究中对玉米SUS基因家族成员进行基因结构分析(图1)，结果显示玉米SUS成员可分为3组，SUSI中ZmSUS1、ZmSUS2均含有14个内含子；SUSII中ZmSUS3含有14个内含子，ZmSUS4含有13个内含子；ZmSUSⅢ中，ZmSUS5含有10个内含子。基因结构示意图显示，ZmSUS1与ZmSUS2以及ZmSUS3与ZmSUS4的基因结构具有高度相似性，与表2中的SUS蛋白氨基酸序列一致性结果相呼应。

2.4 玉米、拟南芥和水稻SUS基因家族系统进化分析

前人对植物SUS基因系统进化研究中，植物SUS基因被分为3组，分别是SUSⅠ、SUSA以及New Group[16]。为了了解玉米SUS家族基因的进化关系，本研究对玉米、拟南芥和水稻3种作物构建系统发育树，进行系统进化分析。图2显示，17个SUS基因分为3组，分别为SUSⅠ、SUSⅡ和SUSⅢ。SUSⅠ中拟南芥SUS基因有2个，水稻SUS蛋白有3个，玉米SUS蛋白有2个(ZmSUS3、ZmSUS4)；SUSⅡ中分布有2个拟南芥SUS蛋白，1个水稻SUS蛋白以及2个玉米SUS蛋白(ZmSUS1、ZmSUS2)；SUSⅢ中分布有2个拟南芥SUS蛋白，2个水稻SUS蛋白和1个玉米SUS蛋白(ZmSUS5)。对水稻、玉米、拟南芥SUS基因进行同源性分析，发现了4对物种内部的旁系同源基因(拟南芥2对，水稻1对，玉米1对)，2对物种间的直系同源基因(ZmSUS4与OsSUS3，ZmSUS5与OsSUS6)。,这些现象表明，在玉米、拟南芥、水稻的基因组中，蔗糖合成酶基因家族按照各自物种的特异性进行了扩展，从而更好的适应环境，这种现象在植物各类基因家族中普遍存在。

2.5 玉米SUS基因启动子分析

对玉米SUS家族蛋白基序进行分析，结果如表4所示，说明SUS基因在植物的生长发育、逆境胁迫等方面发挥了重要作用。玉米SUS家族蛋白预测发现13类基序，可分为4大类，分别为植物激素调控元件、逆境胁迫相关元件、光反应元件和生长发育调控元件。其中涉及激素调控的元件有ABA应答元件、MeJA响应元件、GA应答元件、IAA以及乙烯调控元件；与逆境胁迫(生物与非生物胁迫)相关的元件为干旱响应元件、厌氧诱导元件、低温胁迫调控元件以及真菌诱导元件；胚乳发育以及蛋白代谢调控元件均与植物生长发育调控相关；光反应调控元件在玉米SUS家族基因中数量最多，其中ZmSUS4中含量最大，为12个，ZmSUS1和ZmSUS3最少，均含有7个，表明玉米SUS家族基因成员在植物光合反应的调控过程中均有参与，多数光调控相关基序具有相同或类似功能。除光合作用元件外，玉米SUS家族基因含有植物激素调控元件、逆境胁迫相关元件以及生长发育调控元件的数量都较少，为0～2个。例如在低温调控方面，仅ZmSUS4含有1个调控元件，这表明在植物生长过程中，若ZmSUS4发生突变致使该调控元件功能缺失或变异，因没有相同或类似功能元件替代，在遭遇低温冷害时可能会导致植株生长受阻甚至死亡。

2.6 玉米SUS家族基因组织表达分析

组织特异性表达分析结果显示，玉米SUS基因在不同组织间的表达模式差异明显(图3)。ZmSUS1和ZmSUS2在胚和胚乳中表达较高，在其它被检测组织中很低或者不表达，表明它们可能参与了种子的发育过程。ZmSUS5在根、芽、雄穗及花丝中表达量均很低，在胚、胚乳、花粉中不表达，可认为在玉米的生长发育过程中，ZmSUS5没有参与上述被检测的组织特定时期的生理活动。ZmSUS3及ZmSUS4在被检测的组织中均有较高的表达量，说明它们参与了玉米生长发育过程中的多个过程。

图1 玉米SUS基因结构分析Fig.1 Intron-exon structure analysis of SUS genes in maize

▲代表水稻；■代表玉米；●代表拟南芥图2 玉米、拟南芥、水稻SUS蛋白的系统进化分析和亚组分类Fig.2 Phylogenetic relationship and subgroup division of SUS proteins of maize, arabidopsis and rice

3 讨论

蔗糖作为植物光合作用的主要产物之一。蔗糖合成酶是蔗糖代谢调节过程中的关键酶，在植物的生长发育过程中有着重要作用。通过生物信息学鉴定和分析蔗糖合成酶基因是了解基因的功能、调控模式以及分子机制的第一步。近年来随着植物基因组测序技术的快速发展，已逐渐对水稻[17]、拟南芥[18]、大豆[8]等作物进行了蔗糖合成酶基因家族成员的鉴定，并通过相关工具进行了基因理化性质的分析和功能预测等，发现该基因家族对维持作物的生长发育以及逆境胁迫的应答等方面都具有重要作用。2009年11月，玉米材料B73全基因组测序工作完成[19]，然而对玉米蔗糖合成酶基因家族的研究尚未见报道。本研究中，利用已公布的玉米全基因组数据库，通过生物信息学比对方法，共鉴定出5个玉米SUS家族成员，结果分析显示，除ZmSUS5外，其余各成员在氨基酸长度、分子量、等电点、不稳定系数、亲水性以及基因结构等方面均较为相似，体现了蔗糖合成酶家族基因在进化过程中的高度保守性。基因在进化的过程中一般都具有很高的保守性，但仍有极少数基因会发生突变，从而产生新的生物学功能，促进了物种的进化。氨基酸序列相似性分析表明，ZmSUS1～ZmSUS4相互的序列相似性都较高，其中ZmSUS1与ZmSUS2之间氨基酸序列相似性达97.81 %，表明ZmSUS1与ZmSUS2应互为同源基因，这与Carlson等[20]的研究结果保持一致。前人研究表明，基因的内含子/外显子的排序特征对研究基因的功能和进化关系具有重要的意义[21]。本研究中，玉米SUS家族基因成员的内含子数目在10～14个，同样，大豆和棉花中内含子数量均在11～14个[7,22]，说明不同物种中，蔗糖合成酶家族基因的内含子和外显子的数目是高度保守的。而在各基因中，内含子的位置和长度却存在较大差别。在植物漫长的进化过程中，基因中内含子经过移位或内部之间的非法交换，产生了具有不同功能的新基因，进而形成了最终的基因家族[23]。

表4 玉米SUS蛋白启动子分析

条带代表玉米SUS基因在不同组织的相对表达量，大小用表示图3 玉米SUS家族基因的组织表达分析Fig.3 The relative expression analysis of maize SUS family members in different maize tissues

本文利用玉米、拟南芥和水稻泛素结合酶家族基因的蛋白序列构建系统进化树，旨在研究不同物种间泛素结合酶家族蛋白的进化关系，并通过生物信息学分析结果预测玉米SUS家族基因的功能。系统进化结果显示，玉米SUS蛋白家族可分为3个亚家族，各亚家族SUS基因在进化上表现出差异性，暗示了SUS基因功能的多样性。基因启动子分析结果显示，所有玉米SUS家族蛋白成员均含有多个光反应元件，说明在植物进化过程中逐渐产生了多个同源基因，从而避免了植株在生长过程中由于突变致使单个基因功能的缺失而导致植株生长受阻甚至死亡的现象。同时玉米SUS基因中还含有数量不等的激素调控元件、逆境胁迫调控元件和生长发育相关元件，表明玉米SUS家族成员也与上述相关反应过程有关。对玉米SUS家族成员进行组织特异性表达研究发现，玉米SUS家族基因成员具有不同的表达模式。ZmSUS1与ZmSUS2均为SUSⅠ亚家族中成员，主要在种子胚和胚乳中表达，其它组织中表达量很低或不表达，说明ZmSUS1与ZmSUS2的主要功能与种子的发育过程有关。如拟南芥中的AtSUS2基因只有在开花后10 d左右的种子中高度表达，在其它组织中的表达水平几乎检测不到[5]。水稻中OsSUS4基因主要表达部位在雌蕊以及幼胚，对OsSUS4基因表达进行抑制，导致种子成熟期推迟以及水稻产量变低[4]。通过对玉米SUS家族基因成员表达模式进行分析发现，ZmSUS1、ZmSUS2在种子的胚和胚乳中特异性高表达，但对其如何影响种子的发育过程并不清楚，需后续对该基因做功能抑制或过表达实验进一步研究。SUSII中，ZmSUS3与ZmSUS4在被检测的组织中均有较高程度地表达，说明其表达不具有组织特异性。ZmSUS5分布在SUSⅢ中，在被检测组织中表达量很低或不表达，而在组织内部之间比较，其表达部位为根、芽以及雄穗，在植物生长发育的后期则不表达，这与乔亮等[24]在水稻中对OsSUS5和OsSUS6基因的表达模式的研究结果保持一致，同时也与本研究中进化树分析将ZmSUS5与OsSUS5和OsSUS6划分为SUSⅢ成员的结果相吻合。玉米SUS家族成员在基因表达模式中表现出了差异，这暗示了玉米SUS家族基因在进化过程中其基因功能可能发现了突变和自然选择的作用。

玉米是我国主要的粮食作物之一，在生长发育过程中会遇到干旱、低温和病虫害等各种生物或非生物胁迫，严重影响玉米的产量[25]。蔗糖合成酶作为一直以来研究的热点，近年来被发现与作物抗逆性密切相关。如花生中AhSuSy在高盐或干旱的条件下，其在根部中的表达量明显增加[26]。低温和干旱条件诱导下，橡胶HbSus5基因在叶片和根部中大量表达，表明HbSus5参与了植株的胁迫应答反应[6]。同样，Zuzanna[5]等利用T-DNA插入方法研究拟南芥中各基因的表达模式，结果显示，在植株根部缺氧的条件下，双突变体AtSUS1/AtSUS4植株表现出明显的生长延迟和糖分积累速率变缓，其蔗糖合成酶活性相比野生型植株不足3 % 。本研究中，对玉米SUS家族基因成员启动子进行分析发现，各基因均含有抗逆境胁迫相关元件，表明玉米SUS基因家族可能参与了玉米抗逆境胁迫相关活动，但具体关于玉米SUS家族基因在逆境下的表达特性以及对植株生长发育的影响仍不清楚，需后续进一步对相关基因的功能和分子机制进行研究。