miR-135a-5p在乳腺癌患者血清中的表达及意义

黄俊婷，潘利咸，朱俊琳

(南阳医学高等专科学校第一附属医院肿瘤内科,河南南阳 473000)

乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占全身各种恶性肿瘤的10%，并呈逐年升高趋势[1]。有资料显示，早期乳腺癌患者经手术治疗联合放化疗的治愈率可达90%左右[2]，但临床对于晚期乳腺癌的治疗尚缺乏有效手段，因此，探寻乳腺癌的早期诊断标记物具有重要的价值。糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)是临床常用的乳腺癌诊断指标，其虽具有一定诊断价值，但存在假阳性率高、敏感度低等缺点[3]。微RNA(microRNA,miRNA)是近年来发现的一类长度为18～24个核苷酸的内源性小RNA，既往研究表明，miRNA在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达存在差异[4]，最近有研究报道，miRNA可长期稳定地存在于血浆或血清中，其中，血清miR-135a-5p已被证实与子宫内膜癌[5]、结直肠癌[6]等恶性肿瘤密切相关，但其在乳腺癌中的表达及诊断效能尚未明确。因此，本研究通过对比分析80例乳腺癌患者，50例乳腺增生患者及50例体检健康者血清miR-135a-5p表达水平，旨在为乳腺癌的临床诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2018年1月本院收治的80例乳腺癌患者，50例乳腺增生患者及50例体检健康者为研究对象，均为女性。乳腺癌组年龄32～67岁，平均(48.26±5.35)岁；病理类型：浸润型导管癌42例，浸润型小叶癌38例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期49例，Ⅲ期31例，患者均经组织病理学检查确诊为原发性乳腺癌且为初发病例，术前未接受放化疗治疗。乳腺增生组年龄30～65岁，平均(47.49±4.28)岁，均经临床检查确诊且为初发病例。体检健康组年龄29～71岁，平均(49.03±6.13)岁。本研究经医院伦理委员会批准，且研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清总RNA提取 收集3组血浆样本，于采集48 h内离心处理(1 000 r/min离心10 min)，取上层血清置于-80 ℃的冰箱中保存待检，整个过程避免溶血。分别取血清400 μL，采用血清RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)提取血清总RNA，应用紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)检测RNA的纯度及浓度。

1.2.2反转录反应 按照反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)操作说明书进行操作，将提取的血清总RNA反转录为cDNA，反应体系为20 μL，配制混合物：总RNA 300 ng，5×RT buffer 4 μL，反转录特异性引物1 μL，脱氧核糖核苷酸2 μL，RNA酶抑制剂1 μL，反转录酶1 μL，加焦碳酸乙二酯(DEPC)水补至20 μL。反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min；产物置于-20 ℃保存。miR-135a-5p及内参U6的反转录引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。

1.2.3miR-135a-5p定量PCR检测 采用7500型实时荧光定量PCR扩增仪(美国ABI公司)进行定量PCR检测。反应体系：SYBR GreenⅠ混合液10.00 μL，U6上游引物0.25 μL(5′-CTC GCG CAG CCT TGA CA-3′)，U6下游引物0.25 μL(5′-AAC TTC GGA ATT GCA CTC GT-3′),miR-135a-5p上游引物0.25 μL(5′-ACA GCC TCC ATG GGA ATG GAA GCA GGT TGA-3′),miR-135a-5p下游引物0.25 μL(5′-TGG AGT GTG GCG TTC G-3′),cDNA酶6 μL，无RNA酶水3.00 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，30 ℃ 30 s,共40个循环。采用相对定量法，以U6为内参，各样本中miR-135a-5p的水平为它与同样本中的U6的比值为相对表达水平，由公式Folds=2-ΔΔCt计算获得，ΔΔCt为miR-135a-5p的相对表达水平。

1.2.4CA125水平检测 应用电化学发光免疫分析法测定卵巢癌肿瘤标记物CA125水平，试剂盒由中国联科生物公司提供，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据分析，数据以M(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney U检验，采用ROC曲线评价血清miR-135a-5p在乳腺癌中的诊断效能，以P<0.05为差异有统计学意义。阳性预测值及阴性预测值根据诊断实验评价四格表计算。

2 结 果

2.13组血清miR-135a-5p的相对表达水平及CA125比较 由RT-PCR检测结果可知，乳腺癌组、乳腺增生组、体检健康组血清miR-135a-5p的相对表达水平分别为2.397(1.041，4.362)、0.935(0.398,1.917)、0.918(0.189,1.403)，血清CA125表达水平分别为(179.42±23.69)×103、(43.48±9.47)×103、(9.11±1.62)×103U/L。乳腺癌组血清miR-135a-5p的相对表达水平及CA125表达水平显著高于乳腺增生组和体检健康组，且差异均有统计学意义(U=349.0、308.0,均P<0.01)，而乳腺增生组血清miR-135a-5p的相对表达水平及CA125表达水平与体检健康组比较差异无统计学意义(U=328.0，P=0.167)。

2.2血清miR-135a-5p及CA125对乳腺癌的诊断价值 miR-135a-5p诊断乳腺癌的灵敏度、阳性预测值及阴性预测值均高于CA125，其诊断特异度与CA125相同。miR-135a-5p联合CA125诊断乳腺癌的灵敏度和阴性预测值均有所提升，见表1。

表1 血清miR-135a-5p及CA125对乳腺癌的诊断价值(%)

2.3乳腺癌患者血清miR-135a-5p相对表达水平与其临床病理特征的相关性分析 乳腺癌患者血清miR-135a-5p相对表达水平与肿瘤的TNM分期及分化程度密切相关(P<0.05)，而与患者的年龄、是否绝经、肿瘤大小、病理类型无明显相关性(P>0.05)，见表2。

表2 乳腺癌患者血清miR-135a-5p相对表达水平与其临床病理特征的相关性

2.4ROC曲线分析 采用ROC曲线评价血清miR-135a-5p在乳腺癌中的诊断效能，其曲线下面积为0.847(95%CI：0.609～0.973)，诊断敏感度为91.82%，特异度为77.35%，见图1。

图1 血清miR-135a-5p诊断乳腺癌的ROC 曲线

3 讨 论

乳腺癌为临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年升高且呈年轻化发展趋势，这对乳腺癌的临床防治带来极大挑战[7]。有资料显示，每年全世界约有50万患者死于乳腺癌，尽管手术联合同步放化疗提高了早期乳腺癌的临床治愈率，但对于晚期乳腺癌的治疗尚缺乏有效手段[8]。因此，探寻乳腺癌的发病机制，明确其早期诊断的生物学标志物成为临床研究的重点。近年来，随着临床对乳腺癌标志物的不断探究，miRNA越来越受学者的关注，成为肿瘤生物标志物研究的新领域[9]。miRNA是近年来发现的一类长度为18～24个核苷酸的内源性小RNA，已有研究证实，miR-29[10]、miRNA-241[11]、miRNA-320[12]等与乳腺癌的发生发展存在相关性。虽然miRNA对乳腺癌的早期诊断具有一定价值，但多数研究基于癌组织或细胞miRNA的表达差异，在获得检测miRNA的肿瘤组织时需行穿刺或有创手术等，因此，此种检测方式不便于临床乳腺癌的广泛筛查。

有资料显示，miRNA在血液、唾液及尿液中也能被检测到，且外周血中miRNA作为肿瘤标志物已取得一定成效[13]。王攀等[14]研究报道,血清miRNA-1246与乳腺癌的进展密切相关。另有研究报道，miR-21、miR-195、miR-222在早期乳腺癌患者血清中的表达上调，其对乳腺癌诊断的敏感度分别63.3%、70.0%和70.0%,特异度分别86.7%、93.3%和90.0%[15]。以上研究结果说明，血清miRNA有望成为乳腺癌的诊断标记物，miR-135a-5p为RNA-135家族的重要成员，位于第3号染色体，已被证实与多种恶性肿瘤密切相关[16-17]，而其与乳腺癌的关系尚未明确。

本研究显示，乳腺癌患者、乳腺增生患者、体检健康者血清miR-135a-5p的相对表达水平分别为2.397(1.041，4.362)、0.935(0.398,1.917)、0.918(0.189,1.403)，由此可知，乳腺癌患者血清miR-135a-5p的相对表达水平显著高于乳腺增生患者和体检健康者。结果提示，血清miR-135a-5p的高表达可能与乳腺癌的发生存在一定相关性。TAIPALEENMAKI等[18]研究报道，miR-135在转移性乳腺癌患者血清中呈高表达，这与本研究结果一致。CA125为乳腺癌公认的血清诊断标记物，本研究中，CA125在乳腺癌患者血清中呈高表达。一般较理想的肿瘤标记物应具有灵敏度及特异性高，阳性预测值及阴性预测较为理想的特点。本研究显示，miR-135a-5p诊断乳腺癌的灵敏度、阳性预测值及阴性预测值均高于CA125，其诊断特异度与CA125相同；与单指标诊断结果比较，二者联合诊断乳腺癌的灵敏度及阴性预测均有所提升，结果提示，联合诊断利于提高对乳腺癌的诊断效能。

本研究表明，乳腺癌患者血清miR-135a-5p相对表达水平与肿瘤的TNM分期及分化程度密切相关，而与患者的年龄、是否绝经、肿瘤大小、病理类型无明显相关性。结果提示，分期越高、分化程度越低的乳腺癌患者血清miR-135a-5p水平呈升高趋势，临床监测乳腺癌患者血清miR-135a-5p水平可能对患者病情发展及预后评价有一定意义。进一步采用ROC曲线评价血清miR-135a-5p在乳腺癌中的诊断效能，其曲线下面积为0.847(95%CI：0.609～0.973)，诊断敏感度为91.82%，特异度为77.35%。结果提示，血清miR-135a-5p对乳腺癌具有较高的诊断价值。赵宇明等[19]研究发现，miR-135在前列腺癌患者血清中呈高表达，可作为前列腺癌诊断和预后的标志物。邓道庭[20]研究报道，miR-135b-5p在胃癌外周血中呈高表达。VAN REMVE等[21]研究报道，miR-135b-5p与丙型肝炎病毒(HCV)相关肝癌发生存在相关性。有学者研究发现，miR-135b-5p诊断头颈部鳞癌的敏感度和特异度均较高。以上研究结果表明，miR-135b-5p与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，其或将成为早期恶性肿瘤的一个非侵入性诊断标志物。

综上所述，miR-135a-5p在乳腺癌患者血清中表达明显上调，血清miR-135a-5p对乳腺癌诊断的敏感性和特异性均较高，其或将成为乳腺癌临床诊断的生物学标志物之一。今后，本院会加大对样本量的收集，深入探讨血清miRNA对恶性肿瘤的诊断价值，以期为临床诊疗提供更有价值的参考。