冠心病患者血清miR-140-3p和miR-142-5p水平检测及其与患者心血管结局和死亡率的关系

刘静，马昕怡

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是一种常见疾病，发病率和死亡率非常高，严重危害患者健康。因此，采取有效的方法早发现、早治疗冠心病以及疗效监测病情尤为重要。mircoRNA（miRNA）是一类小分子非编码单链RNA分子，长度约为20～25个核苷酸，在基因转录、表达中起调控作用。研究发现，miRNA在冠心病发生发展过程中扮演着重要角色[1]。miR-206能够通过调控血管内皮生长因子的表达延缓冠心病的发展进程[2]。miR-214在冠心病患者血浆中高表达，与患者冠状动脉狭窄严重程度和冠状动脉（冠脉）狭窄程度积分（Gensini，Gensini's degree integral）呈正相关，可能是冠心病的新生物标记物，同时也是潜在的诊断工具[3]。本研究前瞻性地回顾冠心病血清miR-140-3p和miR-142-5p表达水平，并分析其与患者心血管结局和死亡率的关系，为冠心病患者的早期诊断和治疗提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2011年1月至2014年10月于沈阳市第十人民医院收治的542例由内科医生或心脏病专家确诊的冠心病患者为研究对象，其中男性398例，女性144例，年龄40～85（60.23±11.67）岁。以同期500例正常健康体检者作为对照，男性379例，女性121例，年龄39～76（58.38±12.59）岁。两组年龄、性别等无统计学差异。纳入标准：①有冠脉血运重建或心肌梗死（MI）历史；②至少1个冠脉狭窄程度大于50%；③临床资料记录完整。排除标准：④严重肾、肝以等重要脏器功能不全；⑤自身免疫性疾病；⑥恶性肿瘤患者。所有研究对象或亲属对本次研究知情，并签署了知情同意书。进行随访，收集人口统计学特征、病史等有关信息。对医疗记录进行审查，以确定MI和其他疾病的病史，并记录先前血管造影结果和既往冠状动脉血运重建。

1.2 主要试剂与仪器血管细胞粘附分子1（VCAM-1）试剂盒、高敏C反应蛋白（hs-C R P）试剂盒、N末端脑钠肽前体（N T-proBNP）均购于上海纪宁生物科技公司，总胆固醇、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）均购自南京建成生物工程研究所。miRNA试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒和Realtime试剂盒均购自Invitrogen公司，引物与探针购置Appliedbiosystems公司。AU5800全自动生化分析仪购于贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司，PCR仪购于上海冠森生物科技公司。

1.3 血样采集采集所有受试者清晨空腹静脉血5 ml，置于无菌促凝管中，静置后离心（4℃，1900×g，10 min），收集上层血清，置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 基本指标检测分别按照试剂盒说明测量血清总胆固醇、HDL、LDL、VCAM-1、hsCRP、NT-proBNP。VCAM-1平均间隔和测定内变异系数分别为4.1%和3.3%。所有测量的生化参数批内、批间变异系数均＜5%。根据标准化血清肌酐的肾病研究方程中的最新饮食改变，估计肾小球滤过率（eGFR）[4]。左心室射血分数（LVEF）=（心室舒张末容积-心室收缩末容积）/心室舒张末容积×100%[5]。

1.5 RT-qPCR法检测血清中miR-140-3p和miR-142-5p表达水平按照miRNA试剂盒说明书对血清中miRNA进行提取，采用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以U6为内参，进行检测。反应条件为：95℃预变性1 min，95℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，总共进行45个循环。内参U6、miR-140-3p和miR-142-5p引物序列（表1）。

表1 内参U6、miR-140-3p和miR-142-5p引物序列

1.6 前瞻性随访和结果确定通过对患者或其家属随访，记录患者心血管事件发生情况和存活情况。心血管事件包括MI、因心力衰竭（HF）住院治疗、心血管死亡以及复合终点。并分析血清中miR-140-3p和miR-142-5p表达水平与患者心血管结局和死亡率的关系。

1.7 统计学分析采用统计学软件SPSS 19.0对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用构成比表示，组间比较采用 检验。采用logistic回归分析影响冠心病发生的相关因素。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-140-3p和miR-142-5p表达水平与对照组相比，冠心病患者组miR-140-3p表达水平显著下降（P＜0.01），miR-142-5p表达水平显著上升（P＜0.01，表2）。

表2 两组血清miR-140-3p和miR-142-5p表达水平

2.2 miR-140-3p和miR-142-5p表达与临床病理特征关系分别以冠心病患者血清miR-140-3p和miR-142-5p表达均值0.52、3.09将其分为高表达和低表达组。冠心病血清miR-140-3p和miR-142-5p表达与患者性别、年龄、吸烟状况、血清总胆固醇、HDL和LDL无关，与高血压、糖尿病、MI历史、hsCRP 、NT-proBNP 、VCAM-1、eGFR、LVEF、Gensini得分等相关（表3）。

2.3 miR-140-3p和miR-142-5p表达与患者心血管结局和死亡率的关系随访3年，542例研究对象发生心血管事件的有203例，死亡患者196例。其中miR-140-3p低表达患者发生心血管事件概率占总心血管事件的77.34%，死亡人数占总死亡人数的78.57%，高表达患者分别为22.66%、21.43%。与miR-140-3p高表达患者相比，miR-140-3p低表达患者心血管事件概率和死亡率均显著升高（P＜0.01）。 miR-142-5p低表达患者发生心血管事件概率占总心血管事件的31.53%，高表达患者分别为68.47%、77.55%。与miR-142-5p高表达患者相比，miR-142-5p低表达患者心血管事件概率和死亡率均显著下降（P＜0.01，表4）。

表3 miR-140-3p和miR-142-5p表达与临床病理特征关系

2.4 影响冠心病发生的Logistic分析为进一步分析影响冠心病发生的相关因素，以冠心病是否发生为因变量，以患者性别、年龄、高血压、糖尿病以及hsCRP、NT-proBNP、VCAM-1、eGFR、LVEF、Gensini得分及miR-140-3p、miR-142-5p表达水平为自变量进行Logistic回归分析结果显示，miR-140-3p和miR-142-5p是冠心病发生的预测因子（表5）。

3 讨论

随着人口老龄化进程的发展，心血管疾病在我国的患病率和病死率均较高。冠状动脉较大分支被堵塞时，心肌得不到血液供应而坏死，就会发生心肌梗死，严重时会出现休克、心力衰竭、心律不齐等症状。冠心病是由多种因素引起的疾病，正确的认识、预防及治疗对冠心病患者健康十分重要。

表4 miR-140-3p和miR-142-5p表达与患者心血管结局和死亡率的关系

表5 影响冠心病发生相关因素的Logistic分析

miRNA是一类内源性非编码调控RNA，与mRNA的3'非翻译区靶向结合降解mRNA或者抑制其翻译，从而实现对靶基因的调控，在一系列重大的生命过程中起着重要角色。Mitchell等[6]发现，miRNA在血清或血浆中稳定性非常好，对强酸、强碱及高温、骤冷等条件不敏感，并且能够抵抗RNA酶的降解，提示血清或血浆miRNA可以在临床中作为稳定的生物标记物。近几年的研究发现，miRNA在调节心血管细胞分化、生长、增殖和凋亡以及控制心血管疾病等过程中起关键作用，可作为心血管疾病诊断和预后的新型生物标志物[7]。miRNA能够与一些心血管药物相互作用，提示miRNA作为心血管药物的新靶点和/或调节剂，为新型心血管疾病药物的研制和开发提供新方法[8]。Saxena等[9]报道称microRNA通过靶向基质金属蛋白酶操纵细胞外基质重塑对心血管疾病产生影响，具有成为心血管疾病治疗工具的潜力。Van等[10]研究发现小鼠在心脏损伤期间miR-195过度表达导致其心脏病理性生长和心脏衰竭，揭示了特定miRNA在控制心脏肥大性生长和腔室重塑中具有重要作用，可作为心脏病的潜在治疗靶标。MiR-140定位于人16号染色体短臂，包括miR-140-3p和miR-140-5p，两者均存在于编码E3泛素连接酶WWP2基因的内含子中，在内含子被剪切的过程中被导出。王娓娓等[11]研究发现，miR-140在心肌缺血-再灌注损伤后心肌细胞中表达下降，经治疗后miR-140表达增加，提示miR-140可能是心肌细胞抗凋亡作用的关键调控点。miR-142定位于人17号染色体上，包括miR-142-3p和miR-142-5p，分别由前体3’端和5’端加工而来。研究发现，miR-142-5p在急性冠脉综合征患者血清中高表达，与心肌损伤和心肌炎症反应有关，提示miR-142-5p可能对诊断急性冠脉综合征具有临床价值[12]。冠心病患者血清中miR-142-5p表达水平上调，同时动物实验发现小鼠动脉不稳定斑块中miR-142-5p表达也上调，提示其可能与粥样硬化斑块稳定性相关。本研究结果表明，冠心病患者血清中miR-140-3p表达水平比健康人显著下调，miR-142-5p表达水平显著上调，与miR-140-3p高表达患者相比，miR-140-3p低表达患者心血管事件概率和死亡率均显著升高（P＜0.01），与miR-142-5p高表达患者相比，miR-142-5p低表达患者心血管事件概率和死亡率均显著下降（P＜0.01）。Logistic分析结果显示，miR-140-3p和miR-142-5p是冠心病发生的预测因子。提示miR-140-3p和miR-142-5p均与冠心病密切相关。

hsCRP是能够反映患者体内非特异性炎症反应的敏感指标之一，研究表明hsCRP水平在急性冠状动脉综合征患者血清中表达水平增加，参与动脉粥样硬化的发生、发展过程，不仅与动脉粥样硬化程度相关密切，而且是动脉粥样斑块稳定性的敏感标志[13]。动脉粥样硬化发生早期，hsCRP可能通过上调血管内皮细胞黏附因子VCAM-1等加速黏附进程，使平滑肌细胞增殖、迁移速率加快，诱发斑块形成，可以独立预测斑块的稳定性及血管事件的发生。肾功能异常（血清肌酐水平升高或eGFR降低）是冠状动脉综合征患者死亡的独立预测因子[14]。NT-proBNP主要是由心脏分泌的肽激素，当心室压力负荷或容量负荷增加时，NT-proBNP的合成和释放就会增加，检测其表达可以有效评价心衰患者的预后，是心衰患者出院后死亡或因心血管事件再住院的强有力预测指标[15]。本研究结果表明，冠心病患者血清中，miR-140-3p和miR-142-5p表达与hsCRP、hsCRP 、VCAM-1、和NT-proBNP水平关系密切，提示miR-140-3p和miR-142-5p可能与这些因子协同参与冠心病发展进程，有待进一步证实。

终上所述，冠心病患者血清中miR-140-3p和miR-142-5p表达异常，并且miR-140-3p低表达和miR-142-5p高表达患者心血管事件发生率以及死亡率比miR-140-3p高表达和miR-142-5p低表达患者增加，提示两者均参与冠心病发生、发展过程。但由于本研究未能对不同严重程度冠心病患者进行分组研究，以及miR-140-3p和miR-142-5p在冠心病中的作用机制也不清楚，今后需要更大样本的多中心研究来进一步证实。