抗菌药物耐药性应对策略研究进展＊

黄 祺，唐洪波，胡明冬，梁华平

抗菌药物耐药性（AMR）是微生物（如细菌，病毒和一些寄生虫）阻止抗菌药物（如抗生素，抗病毒药物和抗疟药）对抗它的能力［1］。抗生素耐药菌近年来在全球迅速而广泛地传播，由于AMR的出现，使得传统标准治疗策略变得无效，并且存在传播给其他人的风险。根据现有的研究报道，全球每年约700 000人死于抗生素耐药性，尽管目前很难预估AMR的发生率及死亡率，但预计到2050年，抗生素耐药性导致的死亡人数将增加到每年1000万，经济负担为100万亿美元。不幸的是，尽管目前已有应对AMR的策略，但抗菌药物的耐药率预计仍会不断地增长［2-4］。2009年—2016年中国临床分离菌株（CHINET）细菌耐药性监测结果可以发现，中国的AMR形势也十分严峻［5］。在2016年在杭州召开的 G20峰会上，AMR问题亦被提上各国领导人讨论议程，可以看出AMR问题在全球越来越受重视。作为医务工作者，我们对AMR的认识仍需不断深入，对其治疗新技术的研究进展更需系统地了解，笔者整合了近5年来国内外最新文献，现就快速诊断技术、抗生素新药研发、老药新用、抗菌药物联合运用、噬菌体疗法、免疫疗法、基因编辑技术运用等对策进行概述，鉴于笔者前期发表的综述已撰写了部分措施，该文则重点对快速诊断技术、抗生素新药研发、老药新用、免疫疗法、基因编辑技术运用等对策进行综述。

1 快速诊断技术

机体感染病原菌后，针对病原菌及药敏的检测至关重要，特别是在耐药菌感染方面。因早期经验性选用的抗生素可能对该病原菌不敏感，所以若能早期快速获得准确病原菌及耐药情况，将为临床选用更具针对性及有效性抗生素提供重要作用。目前针对病原菌的快速诊断方法主要包括表型筛查和基因检测。表型筛查主要包括 E-test法、改良Hodge 实验等［6］，但这类方法往往耗时长、特异性差、灵敏度低，极易出现假阳性或假阴性结果。基因检测主要包括普通PCR法、荧光定量PCR法、环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基因芯片技术等［7，8］，这些方法具有快速、特异及敏感等优点。而针对病原菌耐药情况的检测除针对基因检测外，目前针对蛋白检测更加优势，主要包括LC-MS/MS法和PCR-P法。LC-MS/MS法首先获得待测菌株的全蛋白溶液并进行蛋白电泳，多个蛋白条带分别进行酶解后，通过LC-MS/MS获得各条带对应的特异性肽指纹图谱，之后采用Mascot将LC-MS/MS检测结果在Swis-sProt数据库中的细菌分类中进行搜索比对，即可判断待测菌株是否为阳性耐药菌株，该技术除了对产碳青霉烯酶的培养粗提物进行检测外，也成功检测到了动物感染血液中的碳青霉烯酶的存在［9］，新技术的进步对早期耐药菌感染的确诊，并对其开展相应治疗具有重要作用。

2 新药研发

众所周知，新型抗菌药物的研发周期长，资金需求大，研发的速度滞后于细菌对抗生素产生耐药的速度。尽管开发新抗生素的努力从未停止，但新药获批的数量在过去几年却逐步减少。自2010年以来，很少有新的抗生素获得FDA和（或）EMA批准用于抗多药耐药G-菌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验，这其中就包括：头孢唑嗪/他唑巴坦，头孢他啶/阿维嘧啶，美罗培南/他巴比妥，Plazomicin 及 Eravacycline［10］。20世纪70年代以来，仅有2种新型抗菌药物［利奈烷酮类（利奈唑胺）及环脂肽类（达托霉素）］上市并投入临床［11］。近年来，科研人员一直坚持不懈地筛选具有杀灭耐药菌的有效物质，就有学者利用MDR感染的线虫模型，对1300多种药用植物内生真菌提取物进行抗耐药菌作用筛选，并成功发现了4种抗耐药菌有效的提取物。2015年，一种少见的缩肽类化合物被发现并命名为Teixobactin，该化合物多种多重耐药菌有很强抗菌活性，且目前未见有对此药耐药的相关报道，美国NovoBiotic Pharmaceuticals公司现正对其进行进一步研发。此外具有较好抗耐药菌能力的纳米化抗生素 （如纳米金，纳米银）也在被进一步被研发［5］。综上，新药研发策略将给耐药菌的治疗带来了新的希望。

3 老药新用

抗菌药物老药新用指的是将抗菌药物通过采用现代分析和药效、药代动力学等方法对旧抗菌药物重新开发并利用，多黏菌素的临床新运用就是该策略成功的一个案例［12］。2010年新德里金属β内酰胺酶-1（NDM-1）超级细菌被首次报道以来，大部分抗菌药物对之无效，曾一度引起人们恐慌。之后有学者研究报道，多黏菌素在体外具有显著的抗超级细菌能力。目前在全球大多数地区，多黏菌素对G-菌依旧敏感，耐药检出率处于较低水平，因其显著的抗G-多重耐药菌疗效，而被作为危重病患者抗感染治疗的最后防线之一。随着研究继续深入，磷霉素、夫西地酸等老药因在抗MDR菌方面的显著疗效也重获关注［5］。老药新用策略的合理使用，将更有效利用现有资源，并将可能产生的耐药性最小化。

4 免疫疗法

4.1 抗体 抗体是指机体在抗原刺激后而产生的具有保护作用的蛋白质，在人体被动免疫反应中发挥重要作用。因在前期动物实验过程中发现了抗体在抗多重耐药菌感染的积极疗效，日益受到关注。但目前大多数抗体药物正处于临床试验阶段（表1）。

表1 抗多重耐药菌感染的抗体

众所周知，多重耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）已经成为临床感染上主要的耐药阳性菌，MRSA在机体中引起炎症反应及生物膜的形成需要脂磷壁酸参与，Biosynexus公司针对脂磷壁酸研制出的嵌合抗体Pagibaximab，目前该药物已开展相关临床试验。随着广谱抗生素在临床的广泛使用，重症患者发生肠道艰难梭菌耐药菌感染风险逐渐增加，Merck公司研发了针对艰难梭菌毒素的单抗Bezlotoxumab，并在2017年先后被FDA和欧洲药品管理局批准上市，用于成人艰难梭菌的感染治疗当中［13-16］。疫苗的研制为耐药菌的治疗提供了一种新手段。

4.2 疫苗 接种疫苗是预防和控制耐药菌感染的新策略，是减少疾病发生、减少医疗费用的有效手段，在动物模型中取得一定疗效并获得关注。不过针对耐药菌的疫苗的研究，目前大多处于临床前试验或临床试验阶段。

Jiang等［17］将toxAm基因和pcrV基因组合到真核质粒pIRES上组成DNA疫苗pIRES-toxAmpcrV，在小鼠体内，抗铜绿假单胞耐药菌感染中有一定疗效。Merck公司针对金黄色葡萄球菌靶点IsdB设计的亚单位疫苗V710在恒河猴模型中表现出免疫保护作用［18］，针对艰难梭菌毒素A和毒素B设计的亚单位疫苗VLA84，临床试验志愿者在接种疫苗后体内抗毒素A和抗毒素B抗体滴度明显增高，临床预后获得改善，该疫苗现已进入Ⅱ期临床试验［19］。当前结核杆耐药菌在全球肆虐，而唯一针对结核分枝杆菌的疫苗卡介苗对敏感个体及已感染个体缺乏保护作用，H1/IC31疫苗是ESAT6蛋白和结核分枝杆菌抗原Ag85B辅以IC31佐剂制备而成，不过近期临床试验结果显示，该疫苗可以有效增强感染患者保护性免疫能力［20］。

4.3 免疫佐剂 免疫佐剂又称免疫调节剂或免疫增强剂，它可以增强免疫原性、抗体滴度，改变抗体产生的类型并引起或增强迟发超敏反应，现有研究报道其在对耐药菌感染的治疗中可起到辅助作用。早期研究报道了抗菌肽、克拉霉素、磷霉素等具有免疫调节活性的作用，并在抗耐药菌感染中起了一定疗效。近期报道的一种佐剂，以Cremophor EL-35作为表面活性剂，丙二醇作为辅助表面活性剂，该佐剂可以提高血清中免疫球蛋白（Ig）G和相关亚类（如 IgG1，IgG2a和 IgG2b，以及 IgA）的特异性免疫应答，并提高MRSA感染小鼠的存活率［21］。Tocotrienols（T3s）是鲜为人知的维生素E异构体，具有许多生物学特性，已被公认为免疫调节剂，在MRSA引起的伤口感染的小鼠模型，T3S联合达托霉素运用可显著提高达托霉素的疗效［22］。

5 基因编辑技术的运用

抗生素耐药性与抗生素的使用相生相伴，由于抗生素的大量应用，在动物及人体内可诱导出抗生素耐药基因，这些基因进入环境以后，通过横向转移机制诱导耐药菌的产生。目前通过（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）/常间回文重复序列丛集关联蛋白（associated proteins，Cas）CRISPR-Cas 技术可与全基因组测序及耐药性突变筛选结合，使得CRISPRCas工具成为研究热点，并已经用于靶向特异序列的抗微生物制剂的设计生产［23，24］，通过 CRISPR/Cas技术对温和及溶解性噬菌体进行编程，可以致敏并杀死具有抗生素抗性的细菌［25］。Citorik等利用CRISPR-Cas技术设计的靶向特定DNA序列的RNA导向核酸酶（RGNs），该酶可通过噬菌体或携带质粒的细菌有效地传递给微生物群体，靶向作用于微生物与抗生素耐药性和毒力有关的基因序列，从而改善其耐药性及减轻毒力提升感染小鼠模型的存活率［26］。有学者研究发现Cas9重新编程的靶向毒力基因可以杀死毒性金黄葡萄球菌，编程后的基因可破坏具有抗生素抗性基因的葡萄球菌质粒，并在小鼠在体实验中验证了其对金黄色葡萄球菌杀灭功效［27］。

综上所述，当今全球AMR形势十分严峻，对抗AMR之路任重道远。尽管现在针对AMR已经有了较为系统的应对策略，如改进耐药菌快速诊断技术、抗生素管理策略、抗生素新药研发、老药新用、联合运用策略、噬菌体疗法、抗菌肽疗法、免疫疗法、基因编辑技术等，但仍存在一定的局限性。部分策略尚处于研究的早期阶段，不能用于临床，或者临床运用范围较窄，效果有限，如基因编辑技术的实际运用，免疫佐剂、疫苗、抗体疗法等策略。此外应当注意到，目前绝大部分新提出的抗生素耐药性应对策略亟须等待下一步的临床转化，将研究成果转化为确实可行、安全有效的临床抗AMR的新手段、新策略。人们有理由相信在不久的将来，AMR难题逐步会被攻克，耐药问题会得到有效解决。