金耳深层发酵培养基筛选和条件优化研究

康林芝 林小乔 金 磊 门戈阳 刘永吉

（1韶关学院英东食品科学与工程学院，广东韶关512005；2广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东广州510640）

金耳（Tremella aurantialba）为真菌植物门真菌，又称黄木耳。作为一种珍稀的优质食药用真菌，金耳除了含有珍贵的金耳多糖之外，还含有丰富的人体必需氨基酸、蛋白质和维生素等营养物质[1-2]，其具有滋阴养肺、止咳化痰、降血糖、抗氧化等多种药理活性，是一种理想的食品、保健品及高级化妆品原料，商业价值极高[3-7]。目前关于金耳固体栽培配方研究较多，结果显示药渣、棉籽壳作为原料培养金耳的效果较好，但仍存在生物转化率低、培养周期长及成本高等问题[8-10]，因此金耳相关产品的开发与研究工作在很大方面受到了限制。

与人工栽培金耳比较，利用发酵方法获得菌丝体具备更大的优势，例如发酵周期很短、控制培养条件容易、易于实现自动化、不受季节限制等显著优点。目前国内也有关于金耳深层发酵的报道，如汪虹等报道采用玉米粉2%，蔗糖3%，酵母膏0.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%的培养基，接种量为80 mL的条件培养有利于金耳菌丝的生长，已发表的关于金耳发酵条件优化研究论文中试剂均为分析纯，不可直接用于食品开发[11-12]。而且不同菌种的碳氮源利用率及条件都会有所不同，笔者采用全食品级原料，以菌丝体干重为指标，对金耳液体发酵培养基配方及培养条件进行优化[13-15]，获得金耳液体发酵最佳的培养基配方和培养条件，为后续金耳菌丝体及发酵液产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金耳菌种：金耳菌种购买于昆明食用菌研究所。

PDA斜面培养基：新鲜土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1000 mL。

液体种子培养基：PDA培养基中不加琼脂，分装于250 mL锥形瓶中，每瓶100 mL。

发酵基础培养基：每100 mL含葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，VB10.02 g。

培养基中所用原料均为食品级，购买于韶关市新创意实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

金耳菌种活化采用无菌操作方式将母种菌块接种到斜面上，置于25℃培养，至菌丝延伸至整个斜面取出，4℃下保存待用。

种子液的制备：将斜面菌种分割成黄豆大的小块，接种到液体种子培养基中，每瓶接5～8块斜面菌块，摇床振荡培养5～7 d。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 不同碳源对金耳菌丝生长的影响

在发酵基础培养基中，添加0.5 g/100 mL蛋白胨作为氮源，利用不同的碳源研究适宜金耳生长的最佳碳源，碳源分别为3 g/100 mL麸皮、3 g/100 mL玉米粉、3 g/100 mL红薯粉。三种不同碳源的液体培养基分装于250 mL锥形瓶，每瓶100 mL，分别接种金耳液体菌种后于160 r/min摇床中26℃培养7 d。

发酵完成后，将过滤后的菌丝体放入培养皿中，置于干燥箱中60℃烘干至恒重，测定菌丝体干重将其作为评价金耳生物量指标，结果采用统计方法，利用SPSS软件对试验数据进行统计分析，筛选较佳的碳源。

1.2.2.2 最佳碳源添加量对金耳菌丝生长的影响

由1.2.2.1得出金耳液体培养的最佳碳源，在发酵基础培养基中将最佳碳源添加量设为1 g/100 mL、2 g/100 mL、3 g/100 mL、4 g/100 mL、5 g/100 mL并添加0.5 g/100 mL蛋白胨作为氮源。接种、培养方法等同1.2.2.1。

1.2.2.3 不同氮源对金耳菌丝生长的影响

在发酵基础培养基中，添加3 g/100 mL红薯粉作碳源，氮源分别为0.5 g/100 mL蛋白胨、0.5 g/100 mL酵母膏和0.5 g/100 mL大豆粉。接种、培养方法等同1.2.2.1。筛选较佳氮源。

1.2.2.4 最佳氮源添加量对金耳菌丝生长的影响

由1.2.2.3得出金耳液体培养的最佳氮源，在发酵基础培养基中添加3 g/100 mL红薯粉作碳源，最佳氮源添加量设为0.2 g/100 mL、0.4 g/100 mL、0.6 g/100 mL、0.8 g/100 mL、1.0 g/100 mL。接种、培养方法等同1.2.2.1。

1.2.2.5 pH对金耳菌丝生长的影响

发酵基础培养基添加3 g/100 mL红薯粉和0.6 g/100 mL蛋白胨，培养基起始pH分别调为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，接种、培养方法等同1.2.2.1。确定培养基适宜pH。

1.2.2.6 培养温度对金耳菌丝生长的影响

发酵基础培养基添加3 g/100 mL红薯粉和0.6 g/100 mL蛋白胨，调pH为5.0，利用不同温度来研究适宜金耳生长的最适温度，培养温度分别调为22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃，接种、培养方法等同1.2.2.1。确定适宜培养温度。

1.2.2.7 接种量对金耳菌丝生长的影响

发酵基础培养基添加3 g/100 mL红薯粉和0.6 g/100 mL蛋白胨，培养基pH为5.0，接种量分别为1 mL/100 mL、3 mL/100 mL、5 mL/100 mL、7 mL/100 mL、9 mL/100 mL、11 mL/100 mL、13 mL/100 mL。接种、培养方法等同1.2.2.1。确定适宜液体菌种接种量。

1.2.3 正交试验

以最优接种量、pH和培养温度为正交试验因素，结合其他单因素试验的结果，确定每个因素水平，设计正交试验并予以验证，最后得出最优的金耳液体培养条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碳源试验结果

在供试碳源中，碳源为红薯粉时金耳菌丝体生物量最大，菌丝干重达到0.76 g/100 mL，其次为以玉米粉为碳源时，菌丝体干重为0.65 g/100 mL，碳源为麸皮时菌丝干重最低，为0.54 g/100 mL。因此选择红薯粉为后续试验培养基有机碳源。

2.1.2 最佳碳源添加量试验结果

由图1中可看出，红薯粉的添加量对金耳菌丝体生物量影响显著。当红薯粉添加量为4 g/100 mL时，金耳菌丝生物量最大。因此以4 g/100 mL为后续试验红薯粉添加量。

图1 不同浓度红薯粉对菌丝产量的影响

2.1.3 氮源筛选试验结果

以蛋白胨、酵母粉、大豆粉作液体发酵培养基的氮源时，菌丝体生长量分别为0.72 g/100 mL、0.59 g/100 mL和0.31 g/100 mL。由此可知，金耳菌丝对蛋白胨利用效果最好，选用蛋白胨作为后续试验金耳液体培养的主要氮源。

2.1.4 最佳氮源添加量试验结果

图2 不同浓度蛋白胨对菌丝产量的影响

由图2可看出，当蛋白胨添加量为0.6 g/100 mL时，金耳菌丝生物量最大，大于此添加量后，菌丝生物量又呈现下降趋势，其原因可能是高浓度蛋白胨抑制了金耳菌丝生长。以0.6 g/100 mL蛋白胨添加量进行后续试验。

2.1.5 培养基起始pH试验结果

由图3可知，金耳菌丝生长pH范围较广，pH3～6都能生长，但最适菌丝生长pH为5，菌丝生物量达到最大值。

图3 不同pH对菌丝产量的影响

2.1.6 液体培养温度试验结果

由图4可知，温度对金耳菌丝的生物量影响较大，虽然金耳菌丝在22～30℃均可生长，但最适生长温度为24～27℃。

图4 不同温度对菌丝产量的影响

2.1.7 接种量试验结果

由图5可知，金耳菌丝生物量随着接种量的增加而逐渐提高，但考虑到经济性，接种量以7 mL/100 mL较为理想。

图5 接种量对菌丝产量的影响

2.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，以接种量（A）、pH（B）和培养温度（C）进行三因素三水平正交试验（表1），最终确定最优的金耳发酵培养条件，结果见表2。

由表2可见，3个因素中对金耳菌丝生物量影响程度大小为C＞A＞B，即温度＞接种量＞pH。三因素较佳组合A3B2C1，金耳菌丝生物量最高。

验证试验（三重复）结果金耳菌丝体干重1.25 g/100 mL，与正交试验结果较为一致。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

3 小结

通过对金耳液体发酵培养基的碳氮源以及发酵条件进行单因素试验和正交试验，获得了食品级原料发酵培养基，具体配方为葡萄糖2 g/100 mL，红薯粉4 g/100 mL，蛋白胨0.6 g/100 mL，磷酸二氢钾0.3 g/100 mL，硫酸镁0.15 g/100 mL，VB12 mg/100 mL。最佳培养条件为在培养温度24℃，培养基pH5.5，接种量为7 mL/100 mL。此培养条件下金耳菌丝生长旺盛、生物量较高，可为后续金耳发酵液产品规模化生产奠定基础。