杀线虫海洋真菌BH0531发酵液及菌体代谢物对比分析

张金源 杜紫荆 苗利华 李娜 冯欣

【摘 要】杀线虫海洋枝顶孢霉BH0531是以松材线虫为靶标从渤海水域分离获得的一株海洋真菌。为进一步探明其活性代谢物的性质和类型，实验采用非靶向代谢组学分析，对发酵液及菌体代谢物进行定性检测鉴定测定结果显示，发酵液与菌体共有的代谢物160种，只存在于发酵液中的代谢物87种。其中与乙酰胆碱酯酶活性相关物质有3种;促进植株生长作用相关物质有6种;抗氧化相关物质有6种;抑菌相关物质有3种。从代谢物角度为BH0531菌株的进一步开发利用提供实验依据。

【关键词】海洋枝顶孢霉;活性代谢物;非靶向代谢组学

中图分类号： S476.1 文献标识码： A文章编号： 2095-2457（2019）04-0239-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.04.093

Comparative analysis on fermentation broth and bacterial actives of nematicidal  Marine fungi BH0531

ZHANG Jin-yuan1 DU Zi-jing1 MIAO Li-hua1 LI Na1 FENG Xin1，2 MENG Qing-heng1，2* SUN Jian-hua1，2

（1.College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China;

2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， Tianjin 300387， China）

【Abstract】The nematocidal marine-derived Acremonium sp. BH0531 is a marine fungus isolated from the Bohai Seawater with the target of pinewood nematode. In order to further explore the nature and type of active metabolites， the experiment used non-targeted metabolomics analysis to qualitatively detect and determine metabolites from fermentation broth and fungal cell body . The results showed that 160 metabolites shared by fermentation broth and cell body and 87 metabolites present only in the fermentation broth. Among them， there are 3 kinds of active substances related to the activity of acetylcholinesterase; 6 kinds of active substances related to plant growth; 6 kinds of active substances related to anti-oxidation ; 3 kinds of active substances antibacterial related. It provides experimental basis for the further development and utilization of BH0531 strains from the perspective of metabolites.

【Key words】Marine-derived Acremonium sp.;Active metabolites; Non-targeted metabolomics

殺线虫海洋枝顶孢霉BH0531是以松材线虫为靶标从渤海水域分离获得的一株海洋真菌。该菌经形态和分子生物学鉴定为枝顶孢属的波氏枝顶孢霉海栖型变种（Acremonium potronii var. marine BH-0531）[1]，其发酵代谢物具有明确的杀线虫活性[2]，且对根结线虫和腐生性的秀丽线虫杀线效果更强[3]。研究表明，BH0531菌株发酵代谢物除杀线虫活性外，还具有明确的广谱抑菌活性，其中对革兰氏阳性菌作用最为明显[4]，对白色念珠菌也具有明确的抑制作用[5]，并具有改善土壤微生态环境的作用[6]。生物活性分析显示，活性代谢物具有明显的抑制线虫体内抗氧化保护酶系的作用，并对神经递质相关的乙酰胆碱酯酶也具有明显的抑制作用[7]，而对感染线虫的染病植株的保护酶系活性则具有促进作用[8]。为进一步明晰这些生物活性的物质基础和具体作用成分，以及各成分与功能的关系，实验对BH0531菌株及其发酵代谢物进行了进一步的非靶向代谢物组学分析，旨在从代谢物的角度为BH0531菌株的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株

海洋真菌枝顶孢霉（Acremonium sp. BH0531），菌种保藏号CGMCC-5445，由天津师范大学生命科学学院微生物实验室保藏与提供。

1.1.2 供试培养基

保藏及活化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯200g/L煮汁，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，pH自然，蒸馏水定容至1000ml，121℃、0.1Mpa灭菌20min。

基础发酵培养基：察氏培养基3g/L NaNO3，2g/LK2HPO4，4g/LMgSO4，6g/L KCL，0.15g/L FeSO4，25g蔗糖/L，蒸馏水定容至1L，pH值自然，121℃、0.1Mpa灭菌20min。

1.2 仪器与设备

FY-EH-N真空泵：昆山熙日机械设备有限公司;AB Triple TOF 5600/6600质谱仪：AB SCIEX;Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪：Agilent;低温高速离心机 ：Eppendorf5430R;HILIC 色谱柱：Waters， ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm，2.1mm×100mm column;T3色谱柱：Waters， ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm， 2.1mm× 100mm column。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵液的获得

将保藏的海洋枝顶孢霉菌种接入活化培养基，26℃静置培养7d。取新鲜培养的菌株斜面，加入无菌水洗下孢子，制成1×106个/mL的孢子悬液，以2%的接种量接入装有50mL液体基础发酵培养基的锥形瓶中。26℃，120r/min 震荡培养4天，获得发酵液粗液。

1.3.2 待测样品的预处理

菌体收集：将培养好的发酵液经布氏漏斗过滤，将菌体分别收集到1.5mL无菌离心管中，无菌PBS洗涤，5000g 4℃离心5min，弃去上清，收集在离心管中，重复3次。

发酵滤液制备：将布氏漏斗过滤的初级滤液经孔径为0.22μm的微孔膜过滤后获得所需发酵液，保存在15mL无菌离心管中备用。

1.3.3 代谢物组学分析

制备好的待测菌体样本和发酵滤液样本提送上海中科新生命公司（APT）进行非靶向代谢组学分析，测试条件如下：

色谱条件：将样品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统（UHPLC） HILIC色谱柱进行分离; 柱温25℃; 流速0.3mL/min; 进样量2μL; 整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。

Q-TOF质谱条件：将样品分别采用电喷雾电离（ESI）正离子和负离子模式进行检测分析。样品经UHPLC分离后用Triple TOF 5600/6600质谱仪（AB SCIEX）进行质谱检测分析。

2 结果与分析

2.1 发酵液与菌体共有代谢物种类

发酵液与菌体共有代谢物160种，对比结果见表1。

2.2 发酵液特有的代谢物种类

将发酵液代谢物质和菌体代谢物质进行比较分析，得到只存在于发酵液中代谢物共87种，结果在表2给出。

2.3 发酵液中与杀线虫活性相关的主要物质种类分析

将发酵液中特有的代谢物按照功能类型进行归类，归类结果在表3给出。

3 讨论与结论

文献表明青霉酸、橙皮素、甘油磷酸胆碱与乙酰胆碱酯酶活性相关[17]，水杨酸、泛酸、氨基葡萄糖、海藻糖、甜菜碱、3-脱氢莽草酸对植物的保护酶系活性具有促进作用[9-11，13-14，16];3-脱氢莽草酸、泛酸、氨基葡萄糖、葫芦巴碱、橙皮素、甜菜碱对组织抗氧化保护酶系起到抑制作用[11-12，14 ];氨基葡萄糖，青霉酸，橙皮素具有明确的抑菌作用[14，17]。

分析结果显示（见表3），BH0531菌株发酵液中检出上述活性代谢物，分别具有神经毒性、促植株生长、抑制抗氧化保护酶系、抑菌等作用，从代谢物角度为BH0531菌株的杀线虫生物活性提供了实验支撑，并为进一步的靶向分析及海洋真菌杀线剂的开发研究奠定了实验基础。

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