CDK12主要生理功能与其在肿瘤发生中作用的研究进展

李晓军,陶丽梅,朱占弟,聂元华,陈敏学,王 琛*

(兰州大学第二医院a.普外科四病区;b.妇产科,中国甘肃兰州730030)

周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是调节各种细胞过程的重要激酶,可分为细胞周期相关的CDKs(如CDK1/2/4/6)及转录相关的CDKs(如CDK7/8/9/11/12/13)。细胞周期相关的CDKs主要通过调控机体细胞周期中各个时期的进展,直接影响细胞的增殖;转录相关的CDKs主要通过磷酸化C末端域的RNA结合蛋白1(RNA binding protein 1,Rbp1),调节基因转录(表1)。Rbp1是RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNA polⅡ)的最大亚基,也是主要的转录调控因子。由于肿瘤细胞中广泛存在CDK失控及Rbp1等转录调控因子的异常转录,因此Rbp1很有可能成为新的肿瘤治疗靶点[1～2]。

CDK12是一种转录相关的CDK,可使RNA聚合酶Ⅱ碳端氨基酸(carboxy terminal domain of RNA polymerase Ⅱ,RNA pol II CTD)磷酸化,这对于DNA损伤修复(DNA damage repair,DDR)、mRNA剪接以及细胞增殖和分化至关重要[9]。研究表明,在多种恶性肿瘤(特别是乳腺癌)中广泛存在CDK12的基因突变和过表达,抑制肿瘤中CDK12的表达,将有助于人们对CDK12具体生理功能的了解[10]。目前,CDK12抑制剂的相关研究日益受到人们关注,此类抑制剂作为部分肿瘤靶向药物治疗的前景广阔[10～11]。本文初步探讨了当前CDK12在正常细胞及某些肿瘤细胞发生、发展中的作用,这可能为存在CDK12表达异常的肿瘤的靶向药物研究提供帮助。

表1 转录相关CDKs的比较Table 1 The comparison of transcription-related CDKs

1 CDK12简介

2001年,Ko等[12]通过对HeLa细胞cDNA的研究发现了一种新的转录相关激酶,并将其命名为CrkRS(Cdc2-related kinase with an arginine/serinerich domain)。CrkRS由1 490个氨基酸组成,具有一个激酶结构域和脯氨酸、丝氨酸富集区,属于典型的RS蛋白(arginine/serine-rich proteins,RS proteins)家族反式作用因子[12]。2006 年,Chen 等[13]研究发现CDK12主要结合细胞周期蛋白L1和L2,而细胞周期蛋白L1和L2位于剪接因子区,C端含精氨酸和丝氨酸富集的结构域,故CrkRS被重新命名为CDK12。CDK12主要定位于人染色体17q12-pter[14]。Moradian 等[15]通过针对果蝇 CDK12的克隆实验发现,细胞周期蛋白K(cyclin K)为主要的CDK12结合的细胞周期蛋白。在体外,cyclin K/CDK12复合物可使RNA polⅡCTD磷酸化,即CDK12为RNA polⅡCTD致活酶[15]。与此同时,通过开展哺乳动物细胞中cyclin K与CDK12的免疫沉淀反应和质谱分析,Blažek等[16]得出CDK12与cyclin K的结合不但可使RNA polⅡCTD磷酸化,促进细胞转录,而且还与BRCA1(breast cancer susceptibility gene 1)、ATR(ataxia telangiectasia and Rad3-related)、FANC1(Fanconi anemia complementation group 1)和FANCD2(Fanconi anemia complementation group D2)等维持细胞基因稳定性和参与DDR的关键因子表达有关。此外,Bösken等[17]研究发现CDK12也可能作用于RNA polⅡCTD以外的底物,如转录因子或剪接因子等。这些研究表明CDK12可能与转录调控及RNA剪接等细胞过程具有相关性。然而,除RNA polⅡCTD以外,CDK12其他的磷酸化作用靶点和其相关的生物学机制仍有待阐明。

在人类基因组中,最接近CDK12的同源基因是CDK13。CDK13也被称为CDC2L5(cell division cycle 2-like protein kinase 5),含有一个与CDK12激酶域高度序列一致性的激酶结构域(图1)[18]。与CDK12相类似,CDK13也能使RNA polⅡCTD磷酸化,且也能结合cyclin K形成一个独立的复合物[19],但是CDK13的作用靶点并不在RNA polⅡCTD Ser2/5。目前对于CDK13的研究远远少于CDK12,其功能和作用机制不甚清楚[19]。由于CDK13与CDK12的基因编码序列相似,也有人认为这两个激酶可能具有相似的生理功能[19]。

2 CDK12生理功能

2.1 CDK12参与转录调控

图1 CDK12与CDK13的结构示意图(参照文献[18]修改)CDK12与CDK13都具有富含精氨酸/丝氨酸(arginine/serine-rich,RS)、富含脯氨酸(proline-rich,PRM)的结构域以及激酶结构域(kinase domain,KD),但与CDK13相比,CDK12中富含丙氨酸(alanine-rich,Ala)、丝氨酸(serine-rich,SR)结构域相对较少。Fig.1 The structure schematics of CDK12 and CDK13(revised by reference[18])CDK12 and CDK13 both have arginine/serine-rich(RS),proline-rich(PRM)domains and kinase domain(KD),but compared with CDK13,CDK12 has less alanine-rich(Ala)and serine-rich(SR)domains.

研究表明CDK12可使果蝇和人类细胞中RNA polⅡCTD的2号位丝氨酸(Ser2)磷酸化,促进细胞中的转录延伸,但下调CDK12活性并不影响整体转录速率[16～17]。Li等[20]研究发现 CDK12 是果蝇细胞中核呼吸因子2(nuclear respiratory factor 2,Nrf2)相关基因表达的关键酶之一,然而抑制CDK12活性,并不影响大量的DNA转录和mRNA翻译。因此,CDK12可能只是促进某一组特定基因转录的蛋白激酶,抑制CDK12的表达在一定程度上并不影响转录的整体速率[20]。最近有研究指出,在短暂沉默的RNA PolⅡ释放进入转录延伸阶段后,CDK12可通过完全调控PolⅡ相关因子1(PolⅡ-associated factor 1,Paf1)而募集机体转录的基因[21];在使用特异性抗CDK12抗体进行染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-Seq)实验时Chirackal等[22]发现,CDK12能够与RNA polⅡ编码基因、启动子以及具有转录活性的增强子结合,而且ChIP-Seq结果显示CDK12与RNA polⅡ部分序列相重叠。这似乎进一步解释了CDK12可能只促进某一组特定基因的转录。Johannes等[23]研发了一种CDK12抑制剂,即dinaciclib(SCH 727965),研究表明低剂量的dinaciclib(SCH 727965)会降低核心DDR基因如 BRCA1、FANCF(Fanconi anemia complementation group F)和ERCC4(excision repair cross-complementing group 4)的转录速率;而高剂量的dinaciclib(SCH 727965)却只会降低超级增强子相关基因的表达,与转录的整体速率无明显相关性。

CDK12调节转录的特异性主要与CTD中特定丝氨酸有关。之前的研究表明,在体内外CDK12均可使RNA polⅡCTD Ser2磷酸化,促进转录[16～17]。为了明确 CDK12 底物的性质,Bösken等[17]进行了体外激酶实验和免疫沉淀反应实验,结果表明CDK12可使RNA polⅡCTD Ser2和Ser5磷酸化,但此过程需要在RNA polⅡCTD Ser7辅助的基础上进行(图2)[24]。尽管抑制HeLa中CDK12的活性将导致细胞生长障碍,但这种改变对HeLa中RNA polⅡCTD相关丝氨酸整体磷酸化水平的影响不大[10～11]。Zhang等[11]研究表明抑制CDK12活性将导致RNA polⅡCTD Ser2磷酸化效率降低,但RNA polⅡCTD Ser5或Ser7的磷酸化却不受影响。RNA polⅡCTD底物特异性研究一直依赖于CTD特异性抗体,如H5、H14抗体等,但这些抗体的特异性易受到CTD修饰底物的影响[25],使结果产生偏倚,故所得出的结论也容易受到质疑。Schuller等[26]研发了一种适用于修饰RNA polⅡCTD及质谱分析的细胞株,这可能为阐明CDK12及其他CDKs中单个CTD丝氨酸的特异性提供了一种有价值的途径。

CDK12除了调控转录延伸外,还参与转录终止(图3)[24]。裂解刺激因子77(cleavage stimulation factor 77,CstF77)是多聚腺苷酸化的重要因子之一,CDK12可通过招募CstF77使RNA polⅡCTD Ser2磷酸化,后者与MYC(myelocytomatosis oncogene)基因多聚腺苷酸化相偶联并共同作用于mRNA 3＇末端,从而终止转录[27]。CDK12的缺失使RNA polⅡCTD Ser2磷酸化效率减弱、裂解刺激因子64(cleavage stimulation factor 64,CstF64)减少,导致EGF(epidermal growth factor)信号激活后c-Fos(cellular oncogene fos)基因的3＇端修复受损,进而影响mRNA的转录终止[17]。

转录延伸和终止是基因表达的重要调控步骤,这些过程的失调可能会改变抑癌基因或致癌基因的表达水平,从而影响肿瘤的发生发展。目前,CDK12在转录调控中的具体作用机制尚不完全清楚。CDK12是否会影响细胞整体转录或者它是否作为一种特异性的激酶作用于某一组独特的基因(如DDR或增强子相关基因)而调控转录这一根本性问题仍未阐明。

2.2 CDK12参与RNA剪接

图2 CDK12参与转录延伸(参照文献[24]修改)CDK12在RNA PolⅡCTD Ser7的辅助下使RNA PolⅡCTD Ser2/Ser5磷酸化,促进转录延伸。Fig.2 CDK12 is involved in transcriptional extension(revised by reference[24])CDK12 phosphorylates RNA PolⅡCTD Ser2/Ser5 with the help of RNA PolⅡCTD Ser7,facilitating transcriptional elongation.

Moradian等[15]应用质谱分析确定了组成剪接体的几个因子,包括splicing factor 2;SF2/alternative splicing factor;ASF、splicing component 35;SC35、serine/arginine rich protein 40、55、75;SRp40、SRp55和SRp75等。后续研究表明这些因子与CDK12调控的RNA剪接密切相关,但其中大多数尚未被分子内剪接测定和免疫沉淀反应所证实[10,12]。相关研究表明在果蝇神经系统发育过程中,CDK12参与了轴突蛋白IV与mRNA结合蛋白HOW的选择性剪接[21]。另外,在RNA序列检测实验中,Tien等[28]通过对Her2阳性的乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞、正常乳腺上皮细胞MISO进行可变剪接分析,发现CDK12可选择性地调控3＇端外显子的可变剪接以及最后一个外显子的可变剪接。尽管越来越多的研究表明CDK12参与RNA剪接(图4)[24],但CDK12在RNA剪接这一过程中的具体作用及可能的作用机制仍有待研究。

图3 CDK12参与转录终止(参照文献[24]修改)CDK12通过募集CstF77等多聚腺苷酸化因子使RNA聚合酶Ⅱ磷酸化,后者作用于mRNA 3＇端,终止基因表达,促进转录终止。Fig.3 CDK12 is connected to the transcription termination(revised by reference[24])CDK12 phosphorylates RNA polymeraseⅡby recruiting polyadenylation factors such as CstF77,which acts on the 3＇end of mRNA to block gene expression and terminate transcription.

2.3 CDK12参与细胞成熟和分化

尽管目前已经检测到哺乳动物组织、细胞中存在CDK12的广泛表达,但不同组织、器官中CDK12的表达水平均有差异。比如：mRNA检测发现在人类睾丸、卵巢、白细胞和肾上腺中CDK12表达水平较高[16]。此外,在小鼠胚胎干细胞、睾丸细胞中CDK12蛋白水平普遍高于其他分化程度较高的小鼠细胞[29],这表明随着分化程度的增高CDK12的表达水平越低。Chen等[30]研究发现CDK12和(或)CDK13的缺失可能会降低CDK5的表达,导致轴突生长减少,抑制神经元发育和分化。与之相类似的小鼠胚胎研究发现,体外培养去除CDK12或(和)cyclin K的囊胚,由于细胞凋亡增加和DNA损伤修复机制的受损,导致细胞无法大量增殖[31]。免疫沉淀与免疫印迹检测发现CDK12在小鼠胚胎干细胞中高表达,但CDK12/cyclin K复合物的表达却不明显[32],且cyclin K的表达水平随着小鼠胚胎干细胞分化程度的增高而降低,并与Oct4(octamer-binding transcription factor 4)、Sox(Sryrelated high mobility group box)和Nanog等维持细胞多能性蛋白质的表达水平相关[32]。另有研究报道,提高秀丽隐杆线虫细胞中CDK12/cyclin K复合物的活性,可增强秀丽隐杆线虫生殖系中RNA polⅡCTD Ser2的磷酸化水平,使其繁殖能力大幅度提高[33]。虽然,上述研究大部分证实CDK12在促进细胞的分化成熟方面扮演了极为重要的角色,但其发挥作用的可能机制尚未见报道,仍有待于进一步探索。

图4 CDK12参与RNA剪接(参照文献[24]修改)CDK12与剪接体组成因子共同作用于pre-RNA,调节pre-mRNA剪接。Fig.4 CDK12 is linked with RNA splicing(revised by reference[24])CDK12 associates with a component factor of the splicing body to act on RNA sequences and regulate pre-mRNA splicing.

2.4 CDK12参与DNA损伤修复

虽然CDK12在细胞中的具体功能及作用机制尚不完全清楚,但很明显它在DDR中发挥着极为重要的作用[30]。研究表明,抑制CDK12使得BRCA1、ATR、FANCI、FANCD2 等维持基因稳定性关键因子的表达减低,同源重组(homologous recombination,HR)转录活性受到抑制,DNA双链断裂修复效率减低,DDR过程受阻[8,13];CDK12/cyclin K复合物的失活,一方面导致内源性DNA损伤增加,另一方面使细胞中有效执行同源重组的能力受损,进而导致DDR障碍[20,34]。尽管CDK12在DDR中的具体作用机制尚不完全清楚,但可以肯定的是CDK12在维持基因组稳定性和HR转录活性、促进DNA损伤修复中具有不可替代的作用。DDR受损和DNA损伤累积是癌症的典型特征之一[35],以上结果表明CDK12缺乏与肿瘤发生发展密切相关。

3 CDK12与肿瘤的发生发展

3.1 CDK12缺失可能促进肿瘤的发生

通过对乳腺细胞中DNA损伤修复基因的研究,Blažek 等[16]发现 CDK12 和(或)cyclin K 的缺失导致乳腺细胞中长片段基因(＞10 kb)和含外显子数量较多的基因表达减少,DDR相关基因表达降低,包括维持基因组稳定性的关键调节因子BRCA1、ATR、FANCI和 FANCD2的编码基因,CDK12/Cyc K复合物通过调节DDR基因的表达来维持基因组稳定性,CDK12的缺失可能促进乳腺细胞的突变,以及乳腺癌的发生。研究表明参与调控转录、剪接的因子(如CDK12)缺失,一方面直接影响哺乳动物的转录进程,改变大多数细胞的增殖、分化进程,进而使细胞异型性增加;另一方面导致pre-RNA异常选择性剪接,基因序列改变,以上两种改变大大增加了细胞癌变的概率[36～37]。总之,CDK12的缺失可能会导致基因转录或mRNA剪接等细胞过程失控,使细胞异型性增加,从而促进肿瘤的发生,但CDK12缺失后细胞出现异常的具体机制尚未阐明,对CDK12失活的肿瘤细胞进行质谱分析及基因检测可能会对揭示这一规律提供帮助。

3.2 CDK12的缺失使肿瘤细胞对PARP1/2抑制剂敏感

PARP1/2(poly ADP-ribose polymerase 1/2)是DNA修复酶,是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶(caspase)的切割底物,主要通过与DNA单、双链断裂处结合而被激活,参与调节氧化应激诱导的DDR过程[38～39]。PARP1/2抑制剂主要作用于有缺陷的同源重组,抑制肿瘤细胞DDR,发挥其抗癌活性[35]。最近研究表明在高级别浆液性卵巢癌中,CDK12的缺失使得同源重组基因受损,进而导致肿瘤细胞对PARP1/2抑制剂的敏感性增加[40]。虽然最近PARP1/2抑制剂已初步应用于临床治疗,但由于某些肿瘤对PARP1/2抑制剂产生了耐药性,所以目前急需新的治疗方案增加肿瘤对PARP1/2抑制剂的敏感性[41]。

Bajrami等[39]通过肿瘤综合致死率的筛选发现,CDK12是增加PARP1/2抑制剂奥拉帕尼敏感性的重要因子。CDK12表达较低的卵巢癌细胞对奥拉帕尼治疗更敏感,在体内异种移植实验中奥拉帕尼对CDK12短暂失活的肿瘤细胞的治疗作用得到证实[39]。Joshi等[42]也发现在CDK12失活的卵巢癌细胞系中,癌细胞对顺铂、烷基化剂美法仑和PARP1/2抑制剂奥拉帕尼的敏感性增加。此外,在Her2阳性乳腺癌细胞中下调CDK12的表达,肿瘤细胞对PARP1/2抑制剂的敏感性也明显增强[43]。Johnson等[10]通过三阴乳腺癌及人源性乳腺肿瘤异种移植模型的研究发现,CDK12抑制剂dinaciclib可减低奥拉帕尼耐药肿瘤细胞中受损同源重组基因的恢复,联合应用dinaciclib及奥拉帕尼可明显抑制肿瘤生长。因此,CDK12抑制剂的开发可作为减少肿瘤对PARP1/2抑制剂或其他DDR修复系统抑制剂耐药性的一种治疗方案。

4 展望

CDK12是一种与转录相关的周期蛋白依赖性激酶,对DDR、mRNA的剪接及细胞分化、成熟等多个细胞过程的运作至关重要,尽管近些年来CDK12得到了较为广泛的研究,但我们对其功能及作用机制的了解仍然十分有限。建立裸鼠肿瘤模型,上调或沉默CDK12的表达,观察肿瘤的生长及侵袭转移等可能会有助于我们评估CDK12及其相关激酶在肿瘤细胞中的功能。另外,选用特异性CDK12抑制剂和肿瘤相关基因的质谱分析也将有助于鉴别CDK12究竟是一种通用的转录调控因子,还是某个转录阶段的特殊因子。所有这些都可能为后期揭示CDK12在肿瘤发生发展中的具体作用机制以及肿瘤靶向治疗药物的研究提供帮助。

越来越多的研究表明肿瘤中的确存在CDK12的突变和扩增[10,28,42]。最近研发的特异性CDK12抑制剂(如THZ531)不仅是强有力的CDK12研究工具,而且更具有肿瘤靶向药物治疗的前景[11]。目前,已经证明THZ531单药治疗对于CDK12过表达和活化的肿瘤(如乳腺癌等)患者是有效的[10]。此外,CDK12特异性抑制剂的研究也可为PARP1/2抑制剂耐药的肿瘤(如三阴乳腺癌等)进行靶向药物治疗提供一种有效的治疗方案。然而,目前关于细胞中CDK12失活或缺失后将引起怎样的细胞生理、病理反应;某些实体肿瘤(如胰腺癌、胃癌等)是否存在CDK12的异常突变;对化疗或靶向治疗药物不敏感、易耐药的肿瘤组织和细胞中是否广泛存在CDK12抑制剂耐药性;改变这些肿瘤组织和细胞中CDK12的表达水平是否能对肿瘤的靶向治疗进行分子水平的预测等研究难题,国内、外文献尚无相关的报道,期待进一步的研究阐明。