伊曲康唑雾化吸入预防侵袭性肺曲霉病药效学研究

卢鑫 朱颖 王丽 施毅 高海燕 杨健 张秀伟南京医科大学附属江宁医院呼吸内科00;解放军南京总医院呼吸与危重症医学科000

伊曲康唑是临床应用广泛的三唑类抗真菌药物,传统用药方式为静脉及口服给药,主要针对真菌感染的预防性治疗、经验性治疗、针对性治疗和挽救性治疗方面。气道是人体抵御曲霉感染的第一道防线,雾化吸入应用抗真菌药物可在肺局部形成较高药物浓度,发挥抗真菌活性,抑制曲霉菌丝的侵袭性生长。本研究拟通过动物实验观察伊曲康唑雾化吸入、系统给药及联合给药对侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)小鼠生存率及肺部真菌负荷的影响,对雾化吸入伊曲康唑防治IPA 的用药策略做初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及菌株 本研究符合 《赫尔辛基宣言》的原则。选用6周龄雌性清洁级ICR 小鼠60只,分笼饲养,自由进食进水。选用MF13烟曲霉菌株。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及处理 随机分配为4 组,每组15只,设置对照组:感染未用药;腹腔注射治疗组:感染后第2天开始腹腔注射伊曲康唑至第7天;雾化预防组:感染前第2天开始雾化伊曲康唑至第7天;联合防治组:感染前第2天开始雾化伊曲康唑联合感染后第2天开始腹腔注射伊曲康唑至第7天。如图1所示,每组中随机选取9只小鼠观察生存情况,时间截止到感染后第12天;其余6只小鼠在感染后第7天脱颈处死取肺组织匀浆化检测肺真菌负荷,死亡的小鼠立即取肺组织匀浆化检测肺真菌负荷。

图1 实验流程示意图

1.2.2 IPA 动物模型制备 实验小鼠采用以下方法造成免疫抑制状态:环磷酰胺250 mg/kg腹腔注射(感染前第4天及感染前第1天各1次),地塞米松50 mg/kg腹腔注射 (感染前第1天、感染当天及感染后第1天各1次)。免疫抑制后采用气管插管气管内滴入法接种50μl浓度为2×108菌落形成单位/毫升 (Colony-form Units/ml,CFU/ml)的烟曲霉孢子悬液[1]。

1.2.3 雾化吸入给药 小鼠腹腔注射120μl 2%戊巴比妥麻醉后头部固定,连接雾化器启动雾化。用药剂量为30 mg/kg,每天用药一次,雾化时间为60 min。

1.2.4 腹腔注射给药 固定小鼠并翻转暴露腹部皮肤,选择中下腹部为进针点,缓慢注入药液后快速退针,保持此体位30 s,伊曲康唑用量为30 mg/kg。

1.2.5 肺组织真菌菌落负荷检测方法 无菌条件下取小鼠新鲜右肺并匀浆化,电子天平称重后按1 g湿肺组织∶10 ml磷酸盐缓冲液 (含0.1%吐温80)比例稀释,取10μl稀释液接种于沙保弱培养基平板上,置于真菌培养箱内培养,24 h 后读取平板菌落数,假设菌落数为n,按以下公式计算:肺组织的真菌负荷=n×103CFU/g鼠肺组织,换算为Lg[1]。

1.2.6 小鼠存活情况 每日观察各组实验小鼠生存状态直至感染后第12 天,记录小鼠存活情况。绘制生存-时间曲线。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行数据处理,计量资料以±s表示,计数资料以百分数及百分比表示。组间计量资料的比较以单因素方差分析,组间资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 腹腔注射伊曲康唑治疗对IPA 小鼠生存率及肺真菌负荷的影响

2.1.1 生存率比较 将腹腔注射治疗组与对照组进行比较,见图2,腹腔注射伊曲康唑可使IPA 小鼠生存获益,中位生存时间由6 d上升至8 d(P=0.039)。

2.1.2 肺真菌负荷比较 见图3,对照组肺真菌负荷为5.383±0.196,腹腔注射治疗组为4.817±0.154,2组比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。腹腔注射伊曲康唑可显著降低实验小鼠肺组织真菌负荷。

2.2 伊曲康唑雾化预防用药对IPA 小鼠生存率及肺真菌负荷的影响

2.2.1 生存率 见图2,雾化伊曲康唑预防性用药与对照组(感染未治疗)比较小鼠生存获益,中位生存时间由6 d上升至＞12 d (P=0.002),但与腹腔注射治疗组比较小鼠生存率无明显提高(P=0.080)。

图2 雾化预防组与腹腔注射治疗组及对照组相比对IPA小鼠生存时间的影响

2.2.2 肺真菌负荷 见图3,腹腔注射治疗组肺真菌负荷为4.817±0.154,雾化预防组肺真菌负荷为4.233±0.199,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05),与腹腔注射治疗组比较,雾化伊曲康唑预防性用药可显著降低实验小鼠肺组织真菌负荷。

图3 雾化预防组与腹腔注射治疗组相比对IPA 小鼠肺真菌负荷的影响

2.3 伊曲康唑雾化预防及腹腔注射治疗联合应用对IPA 小鼠生存率及肺真菌负荷的影响

2.3.1 生存率 见图4,联合防治组与腹腔注射治疗组相比较,小鼠生存率提高(P=0.028)。

图4 联合防治组与腹腔注射治疗组及对照组相比对IPA小鼠生存时间的影响

2.3.2 肺真菌负荷 见图5,与腹腔注射治疗组(4.817±0.154)相比较,联合防治组 (3.942±0.188)能有效降低小鼠肺真菌负荷 (P=0.005)。

3 讨论

真菌感染是肿瘤化疗、实体器官及干细胞移植受者等免疫抑制人群较常见的机会性感染之一[2]。尽管不断有新的抗真菌药物投入临床,但IPA 一经诊断往往较难治愈,病死率高达50%～80%,占住院死亡患者总数的4%[3]。针对高危人群IPA的防治逐步为医师所重视。治疗策略也不断完善,主要包括:预防性治疗、经验性治疗、针对性治疗和挽救性治疗。

抗真菌药物的雾化吸入给药最早于1988年提出,为使药物抵达肺泡内,要求雾化器可将药液转化为直径介于0.5～5μm 的药物微滴[4]。已有多项体外实验研究证明利用现有雾化设备所产生的AmB药物微粒中位直径 (mean mass aerodynamic diameter,MMAD)在1.31～3.7μm[5-7],伊曲康唑MMAD 在2～3 μm[8-9],米卡芬净在1.67～2.2μm[10]。国内学者在AmB、氟康唑等抗真菌药物雾化吸入给药的临床研究中虽未涉及MMAD 等雾化效率指标,但良好的临床效果同样显示了应用国产雾化装置的可行性[11-13]。

图5 联合防治组与腹腔注射治疗组相比对IPA 小鼠肺真菌负荷的影响

对多种抗真菌药物雾化吸入研究均采用注射制剂。药代动力学研究显示,动物接受AmB 雾化吸入6周后肺组织药物浓度依然高达7.7～14.3μg/g湿肺组织[5];有学者报道雾化吸入AmB 后半衰期为1.3～4.5 d,同时血药浓度维持在0.2 mg/L 以下[14]。雾化吸入伊曲康唑0.5～1 h后肺组织药物浓度达到峰值,超过11.0μg/g湿肺组织[15-18],药物半衰期为7 h。另有研究者报道伏立康唑雾化吸入后血药浓度峰值达到7.1 mg/L[19]。

关于抗真菌药物雾化吸入防治IPA 疗效研究分为动物实验和临床研究两个方面,Am B 雾化吸入已有6项临床研究数据得到报道,有关Meta分析结果显示,针对高危人群雾化吸入AmB 能有效预防IPA 的发生[20]。其他抗真菌药物雾化吸入研究尚局限于动物实验阶段。在探讨雾化吸入给药有效性时往往将“腹腔注射AmB 治疗”做为治疗真菌感染的金标准,相关研究发现预防性雾化吸入伊曲康唑小鼠生存率明显高于Am B 腹腔注射治疗组[17,21]。但目前Am B 已不作为治疗IPA 首选用药,以此标准仅能初步判断抗真菌药物雾化吸入有可行性,难以对伊曲康唑雾化吸入药效学进行准确评价。本研究将伊曲康唑腹腔注射用药作为标准,对雾化吸入用药在预防、治疗的药效学进行综合评估,并对两种给药方式联合应用进行评价。动物实验中往往在感染前第2天开始给药定义为预防性用药,感染后第2天开始给药定义为治疗性用药[22]。从生存率及肺部真菌负荷两个方面加以评价。肺部真菌负荷有两种检测方法:平板菌落计数和荧光定量PCR,其中平板菌落计数是经典方法,应用也最为广泛。

本研究首先观察了腹腔注射伊曲康唑治疗对IPA 小鼠病死率及肺真菌负荷的影响,结果显示可提高小鼠生存率并降低肺真菌负荷,证明腹腔注射伊曲康唑治疗IPA 是有效的。

观察伊曲康唑不同给药方式及治疗策略的治疗效果,研究发现与伊曲康唑腹腔注射治疗相比,雾化预防组及联合防治组可明显减少实验小鼠死亡并降低肺真菌负荷,推测在粒细胞缺乏小鼠肺内保持高药物浓度,可有效抑制进入气道的曲霉孢子萌发,联合腹腔注射伊曲康唑达到较高血药浓度,对侵袭生长的曲霉产生持续作用。

IPA 治疗效果差,新药研制周期长,探索已有药物新的用药方式及各种用药方式联合应用可能对治疗疾病带来益处。本研究仅对伊曲康唑雾化吸入给药疗效做初步探讨,可见伊曲康唑雾化作为高危人群预防性用药及与系统给药联合应用可能具有潜在的应用价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突