基因芯片法与线性探针法对痰标本中结核分枝杆菌检测的应用价值

钟业腾，吕志辉，林 翀，林明冠，陈灼霖，苏应仙，陈少文，裴 华

(1. 海南医学院第二附属医院检验科，海南 海口 570311； 2. 海南省临高县疾病预防控制中心检验科，海南 临高 571800)

结核病是当前危害人类健康最重要的慢性传染病之一[1]，是全世界公共卫生面临的重大威胁[2]。目前，全球结核病控制工作面临着耐药结核病疫情的严峻挑战[3-4]，世界卫生组织(WHO)估计约2/3的结核病患者处于耐多药的危险中[5]。实验室的传统检测方法主要是痰涂片、痰培养及药敏，临床上诊断结核病的金标准是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的培养[6]，而诊断耐多药结核病的传统方法是抗结核药物敏感试验[7-8]。传统检测方法虽可靠，但费时、费力，不能完全满足临床诊疗需求，还可能造成耐多药菌株增多和传播[9]。因此，建立早期、快速的耐药性检测技术是当前控制结核病疫情的关键。目前，临床实验室用于检测 MTB的快速分子生物学方法主要有基因芯片法和线性探针法，两种方法均是通过检测标本中 MTB 及其耐药相关基因突变情况，判定是否感染 MTB 及其对利福平、异烟肼的耐药情况，具有快速、简便等特点，一次能同时检测十几至几十个基因位点，适用于多位点分析[10]。国内很多地区开展了基因芯片法或线性探针法检测 MTB 及其耐药基因，可能是出于经济成本的考虑，基本采用单个基因检测方法，极少比较基因芯片法和线性探针法检测 MTB及其耐药基因效果的相关报道[11]。在结核病防治工作中，患者痰是最直接的标本来源，直接检测痰中 MTB 及其耐药基因，能更快地获得 MTB 耐药结果。本研究采用基因芯片法、线性探针法对海南地区疑似肺结核患者送检的痰进行检测，并与改良罗氏培养法进行比较；以比例法药敏试验为金标准，分析上述两种方法检测利福平和异烟肼耐药性的效能。

1 对象与方法

1.1 研究对象 根据国家卫生与计划生育委员会制定的肺结核病诊断标准[6]，凡符合下列之一均纳入疑似肺结核患者：(1)有肺结核可疑症状的5岁以下儿童，同时具备肺结核患者密切接触史、结核菌素试验强阳性和γ-干扰素释放试验阳性中任一条；(2)仅胸部影像学检查显示与活动性肺结核相符的病变。

按照以上诊断标准，将海南医学院第二附属医院2018年3—7月门诊和住院的106例疑似肺结核患者纳入研究范围，其中男性 76 例，年龄 17～84岁，女性30例，年龄1～87岁。每例患者留取3份痰标本，每份标本2～3 mL，留取质量较好的痰标本2份，各取1 mL混匀，共获得106份混合痰标本，每份2 mL。每份标本同时进行结核菌涂片、改良罗氏培养药敏试验、基因芯片及线性探针耐药基因检测，质控菌株为 H37Rv ATCC 27294标准株，由国家疾病预防控制中心(CDC)结核病参比实验室提供。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 SlideWasherTM8芯片洗干仪、Bi-oMixerTMⅡ芯片杂交仪、ExtractorTM36核酸快速提取仪和 LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪等均为博奥生物集团有限公司生产，TwinCubator振动平台仪器为德国 Hain Lifescience公司生产，TC-96/G/H(b)B基因扩增仪和 Life Express基因扩增仪均为杭州博日科技有限公司生产，BSC-1600ⅡB2型和 BSC-1600ⅡA2型生物安全柜均为苏州安泰空

气技术有限公司生产，BPX-272电热恒温培养箱为上海博迅公司生产。

1.2.2 试剂 MTB DNA 提取试剂和晶芯结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(DNA 微阵列芯片法)均为北京博奥生物集团有限公司生产，GenoType MTBDRplus试剂盒(PCR-线性杂交酶显色法)为德国Hain Lifescience公司生产，分枝杆菌药敏培养基(比例法)、改良酸性罗氏培养基(培养法)、结核菌抗酸染色液、对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鉴定培养基均为珠海贝索生物技术有限公司生产。

1.3 痰标本处理及痰涂片抗酸染色检查 取患者痰标本直接进行痰涂片镜检，严格按照《结核病实验室检验规程》[12]的要求进行痰涂片抗酸染色检查，再加入等量的现配4%NaOH 溶液，涡旋振荡混合后，室温静止15 min，制成预处理痰标本。

1.4 改良罗氏培养法及菌种初步鉴定 用无菌吸管吸取已预处理的痰标本上清液，各取0．1 mL(2滴)分别接种至改良罗氏培养基、PNB和 TCH 鉴定培养基上，尽量使菌液均匀铺满斜面，置37 ℃培养，培养第3天观察结果后，每周各观察1次，直到第8周。

1.5 比例法药物敏感试验 用一次性无菌接种环刮取改良酸性罗氏培养基上(2～3周)的新鲜菌落，置于磨菌瓶中，研磨后与标准麦氏管比对制成1 mg/mL菌悬液，用灭菌生理盐水稀释成10-2mg/mL和10-4mg/mL 2个浓度，然后用一次性无菌接种蘸取1环(即10 μL)，采用划线法分别均匀接种至中性罗氏培养基和含利福平(40 mg/L)、异烟肼(0．2 mg/L)的药敏培养基上，37 ℃培养4周后观察结果。

1.6 DNA提取 吸取1 mL已进行预处理的痰标本上清液于微量离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃去上清液；再加入1 mL的生理盐水，充分振荡后12 000 r/min离心5 min，弃去上清液；向微量离心管加入50 μL核酸提取液，混合均匀后，吸取所有混合液放入核酸提取管中，用核酸快速提取仪振荡10 min，再置于95 ℃水浴10 min，12 000 r/min离心1 min，制备成核酸提取物。

1.7 PCR扩增及杂交

1.7.1 基因芯片法 把 PCR 扩增试剂1、2、3(分别含有 MTB鉴定基因扩增引物、耐利福平rpoB基因扩增引物、耐异烟肼katG/inhA 基因扩增引物)按18 μL/管分装于 PCR管中，将所得核酸提取物2 μL依次加入到PCR管中，混匀，每个标本重复3次，放入基因扩增仪进行扩增，得到PCR产物。将PCR产物经变性后按照说明书要求加入至 MTB耐药检测试剂盒的芯片点阵中，然后放入晶芯 Bi-oMixerTMⅡ杂交仪进行芯片反应，再将完成杂交的芯片放入晶芯SlideWasherTM8芯片洗干仪中进行洗干，将洗干的芯片放入晶芯 LuxScanTM10K-B 微阵列芯片扫描仪中，利用晶芯结核分枝杆菌药敏检测分析系统进行信号的读取及结果判断。

1.7.2 线性探针法 取核酸提取物5 μL加入用多重 PCR扩增体系(含有 MTB 鉴定基因扩增引物、耐利福平rpoB基因扩增引物和耐异烟肼katG/inhA基因扩增引物)中，放入基因扩增仪进行扩增，所得PCR产物与GenoType MTBDplus试剂盒中的探针试纸按说明书进行杂交，并判断结果。

1.8 质量控制 严格按照《结核病实验室检验规程》的要求进行质量控制，痰标本分枝杆菌分离培养的涂阳培阴率应小于10%，污染率应小于5%；比例法药物敏感性试验的高稀释度菌液(10-4mg/mL)在中性罗氏培养基(对照培养基)上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。海南医学院第二附属医院结核病实验室每年均通过国家抗结核药敏试验熟练度考核及结核病分子诊断技术能力验证。

1.9 数据处理 应用 SPSS 20．0统计学软件对实验结果进行处理，两种方法的一致性检验用Kappa检验判别(Kappa≥0．75，两者一致性较好；0．4≤Kappa<0．75，两者一致性一般；Kappa<0．4，两者一致性较差)，采用卡方检验比较两种方法检测结果，P≤0．05为差异有统计学意义[13]。

2 结果

2.1 痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养结果 对106份痰标本进行涂片抗酸染色和改良罗氏培养，痰涂片抗酸染色阳性率34．91%(37/106)，改良罗氏培养阳性率52．83%(56/106)，涂阳培阴性率为8．11%(3/37)，未出现培养污染标本，两者均符合质量控制的要求。56份培养阳性痰标本经PNB及TCH 培养鉴定，46株为 MTB和10株为非结核分枝杆菌。

2.2 基因芯片法和线性探针法MTB检出情况 106份痰标本，基因芯片法检出分枝杆菌52株，其中46株 MTB，6株非结核分枝杆菌；线性探针法检出 MTB5 3株，基因芯片法、线性探针法 MTB的检出率分别为43．40%、50．00%。基因芯片法、线性探针法与改良罗氏培养法检测 MTB 结果比较，差异均无统计学意义(均P>0．05)。见表1。

表1106份痰标本基因芯片法和线性探针法 MTB检出情况

Table1Detection of MTB from 106 sputum specimens by gene chip method and linear probe method

方法改良罗氏培养法(份)阳性阴性χ2P基因芯片法阳性40659.681.00阴性654线性探针法阳性391436.910.19阴性746

注：以改良罗氏培养法为金标准

2.3 基因芯片法和线性探针法检测MTB对利福平、异烟肼的耐药性 以比例法药敏试验为金标准，鉴定为 MTB的46株菌株均进行比例法药敏试验。同时采用基因芯片法和线性探针法检测46株 MTB对利福平、异烟肼的耐药性，两种方法分别检测出40、39株菌对两种药物的耐药结果。

2.3.1 基因芯片法和线性探针法检测MTB对利福平的耐药性 基因芯片法、线性探针法与比例法检测 MTB对利福平的耐药性比较，差异均无统计学意义(均P>0．05)，具有较好一致性(Kappa分别为0．85、0．78)。见表2。对利福平的耐药性检测，基因芯片法和线性探针法的灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值、阴性预测值见表3。

表2基因芯片法和线性探针法检测 MTB对利福平的耐药结果

Table2Rifampicin resistance of MTB detected by gene chip method and linear probe method

方法比例法(株)耐药敏感PKappa基因芯片法耐药2221.000.85敏感115线性探针法耐药2230.630.78敏感113

表3 基因芯片法和线性探针法检测 MTB对利福平耐药情况的诊断效能(%)

2.3.2 基因芯片法和线性探针法检测MTB对异烟肼的耐药性 基因芯片法、线性探针法与比例法检测 MTB对异烟肼的耐药性结果比较，差异均无统计学意义(均P>0．05)，但一致性一般(Kappa分别为0．70、0．59)。见表 4。对异烟肼的耐药性检测，基因芯片法和线性探针法的灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值、阴性预测值见表5。

表4基因芯片法和线性探针法检测 MTB对异烟肼的耐药结果

Table4Isoniazid resistance of MTB detected by gene chip method and linear probe method

方法比例法(株)耐药敏感PKappa基因芯片法耐药1810.220.70敏感516线性探针法耐药1730.730.59敏感514

表5 基因芯片法和线性探针法检测 MTB对异烟肼耐药情况的诊断效能(%)

3 讨论

临床实验室通常会对疑似肺结核患者的痰标本进行涂片抗酸染色和传统培养，为临床诊断提供实验室的确诊数据；但痰涂片抗酸染色阳性率偏低，又无法鉴定是否为 MTB，也不能区分死菌与活菌，不足以满足临床需求[14-15]；传统培养法虽可以分离鉴定 MTB并可进行药敏试验，但是检测时限过长，也不能满足临床诊疗及患者的需要[16]。随着分子生物学的快速发展并在结核病的诊疗领域广泛应用，线性探针法和基因芯片法均很好地用于 MTB耐药基因检测，原来至少需4～8周的时长，最快可缩短至1 d，节约临床的诊断时间，也可防止MDR-TB的蔓延[17-18]。

基因芯片法与线性探针法虽检测时长相差不大，但基因芯片法配有杂交仪、洗干仪及扫描仪等整套设备，自动化程度较高；而线性探针法仅配有杂交仪，杂交、洗涤及结果判读等实验步骤均需人工操作，人为影响因素较大，杂交时标本及探针试纸也暴露于空气中，容易造成交叉污染，但线性探针具有仪器设备投入成本低、试剂成本相对较低的优势。

本研究从检出 MTB阳性率的角度分析了改良罗氏培养法、线性探针法及基因芯片法的优劣性。本研究中线性探针法 MTB检出率为50．00%，低于郭明日等[19]报道的58%；基因芯片法 MTB检出率为43．40%，高于吴国兰等[20]报道的32．5%，两种方法 MTB检出率可能与患者所留痰标本的质量及保存条件有关。基因芯片法和改良罗氏培养法可直接鉴定出非结核分枝杆菌，而线性探针法不能鉴定出非结核分枝杆菌，因为线性探针法检测耐药基因试剂盒没有相关检测基因序列。线性探针法、基因芯片法对 MTB 的检出率与改良罗氏培养法比较，差异均无统计学意义，说明基因芯片法和线性探针法均可很好地应用于痰标本中 MTB的鉴定。

以比例法药敏试验为金标准，采用基因芯片法和线性探针法检测痰标本中 MTB利福平和异烟肼耐药基因，基因芯片法对利福平和异烟肼的灵敏度为84．62%、69．23%，特异度为90．00%、95．00%，低于文献[21-22]报道的结果，可能与地域差异或方法学的熟练度有关。线性探针法对利福平和异烟肼耐药基因检测的灵敏度为84．62%和65．38%，特异度均为85．00%，均低于文献[23-24]报道(用线性探针法针对临床分离株进行检测)，本研究采用线性探针法直接检测痰中 MTB耐药基因。本研究采用线性探针法检测痰标本，效果不如直接对临床分离株检测耐药基因好，但可节省2～4周的时间[25]，可有效快速指导临床用药。对海南地区疑似肺结核患者的痰标本进行 MTB 的耐药基因检测，基因芯片法比线性探针法检测效果相对好，可能是线性探针法在杂交过程与结果判读均为人工，也可能是方法学或检测的耐药基因位点不同所致。

本研究检测痰标本 MTB 中利福平耐药基因，分别将两种耐药基因检测方法与比例法药敏试验比较，结果差异均无统计学意义，具有较高一致性，故两种耐药基因检测方法在检测 MTB对利福平的耐药性中有较好稳定性。检测 MTB对异烟肼的耐药性时，两种方法与比例法药敏试验比较，差异均无统计学意义，但一致性一般，结果与欧维正等[11]研究有所不同，可能与地域差异或方法学的熟练度有关。

本研究也存在一些局限性：(1)由于成本问题，本研究标本数量相对不足，尤其是三种方法共同检测阳性标本相对较少，在耐药性评价中存在局限性；(2)两种耐药基因检测方法所检测耐药基因位点有所不同，故无法对其基因突变类型进一步比较分析。研究首次采用两种基因检测方法直接检测疑似肺结核痰标本中 MTB及其相关耐药基因，比较全面、客观地评价这两种基因检测方法在本地区结核病诊断中应用价值，为临床实验室方法学选择及临床诊疗提供参考。

综上所述，基因芯片法和线性探针法均可在海南地区疑似肺结核痰标本中快速准确鉴定MTB，也适用于结核分枝杆菌对利福平及异烟肼耐药性快速检测，值得临床推广。