锌型复合无机抗菌材料的制备及性能研究

2019-04-17毛华明唐晓宁蒋先发叶孟婕杨苏娥

人工晶体学报 2019年3期

毛华明，张彬，唐晓宁，蒋先发，叶孟婕，杨苏娥

(1.昆明理工大学理学院，昆明 650500；2.昆明理工大学化学与工程学院，昆明 650500)

1 引言

无机抗菌材料因具有高安全性、广泛抗菌性、稳定、抗菌持久等特点，所以具有广泛的应用领域和发展前景。无机抗菌材料主要是将银、铜、锌离子及其氧化物等通过离子交换、物理吸附或电沉积的方式担载到载体上而制备的[1]。抗菌材料的载体有高岭土、石墨烯、纤维素、无定形二氧化硅等[2-5]。无定形二氧化硅是一种白色、无毒的微细粉体材料，具有稳定性好、孔隙多、吸附性强等优异性能[6]，是一种较好的载体材料。锌相比于银和铜其抗菌性能相对较弱，但银型无机抗菌材料的制备成本较高，且易氧化变色；由于铜离子的颜色，限制了铜型无机抗菌材料的使用范围。锌型无机抗菌材料具有生产成本低、稳定性好、白度高，具有良好的生物相容性等优点，而且可根据不同的需求制备出不同形状的氧化锌，如棒状球状花瓣状等[7]，但是其抗菌性能相对较低，因此提高锌型无机抗菌材料的抗菌性能将会是研究的热点[8]。

稀土元素有着独特的4f电子层结构，易配位形成配位化合物，使其在催化剂、永磁材料、荧光材料等领域广泛应用，有研究报道指出稀土可以提高无机抗菌材料的抗菌性能[8]。因此本研究采用溶胶-凝胶法制备出无定形二氧化硅为载体，以Zn2+为主要添加剂，并掺杂稀土Tb3+，选用液相浸渍法制备得到抗菌性能优异的锌型复合无机抗菌材料。

响应曲面法是一种利用数学和统计学，应用建模分析确定各单因素及各因素之间交互作用关系，从而达到优化响应目的的方法，是目前运用最为广泛的试验优化方法[9]。为了得到材料的较佳制备条件，基于单因素实验分析，确定实验条件范围，利用响应曲面法，重点考察主要影响因素(Zn2+浓度、pH、Tb3+浓度)之间的交互作用对抗菌率的影响，对实验影响因素进行优化，得到较佳制备工艺条件，并对锌型无机抗菌材料的性能进行表征。

2 实验

2.1 锌型复合无机抗菌材料的制备

按一定比例量取碳酸氢钠和硅酸钠装入两个容器中，放入90 ℃的水浴锅中预热，将搅拌器转速调至400～500 r/min，将部分碳酸氢钠和硅酸钠倒入反应器中充分搅拌。待溶液反应完成后，将搅拌器转速调至200 ～300 r/min，将剩余的碳酸氢钠和硅酸钠倒入反应器中搅拌。溶液反应一段时间后，用硝酸溶液调pH至1～3，反应10 min后滴加表面活性剂，反应30 min后，冷却抽滤，放入烘箱干燥，即可得到二氧化硅载体。将制备好二氧化硅载体超声分散在水溶液中，在磁力搅拌下滴加20 mL Zn2+溶液，反应5 min后滴加20 mL Tb3+溶液，液相浸渍30 min后，用10%～30%的氨溶液调pH至9，反应60～120 min后，离心洗涤，在200～300 ℃下煅烧120 min，即得到锌型复合无机抗菌材料。

2.2 响应曲面优化

由于锌型复合无机抗菌材料的抗菌性能受Zn2+浓度、pH、Tb3+浓度、搅拌速度和反应时间等的影响。在本次实验中，固定搅拌速度200～300 r/min、反应时间2 h，考察Zn2+浓度、pH值和Tb3+浓度三个因素对抗菌性能的影响。以大肠杆菌为实验菌种，对材料进行抗菌性检测，初步选取锌型复合无机抗菌材料较佳制备条件的实验范围如下，Zn2+浓度：0.2～0.4mol/L；pH: 8～10；Tb3+浓度：0.005～0.02 mol/L。初步选定实验范围后，运用Design-Expert软件中的Box-Behnken(BBD)中心组合实验设计方法进行优化模拟，得到制备材料的较佳工艺条件。

2.3 性能表征

2.3.1 材料形态表征

选用由荷兰帕纳科有限公司生产的X射线衍射仪(XRD，型号：X/pert-3，非单色Cu Kα辐射源)，在2θ为10°～80°范围内以50 eV的通过能量进行检测，分析其衍射谱图，研究材料的形态。

2.3.2 分子结构表征

通过傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR，德国BRUKER光谱仪器公司的TENSOR37型，扫描频率范围400～4000 cm-1，扫描次数：64，分辨率4 cm-1)，研究Zn2+与Tb3+的加入对二氧化硅载体的分子结构和化学键是否产生影响。

2.3.3 材料形貌表征

采用美国FET公司超高分辨低真空场发射扫描电子显微镜(NOVA NANOSEM 450)，在放大倍数为10 K和25 K下观察材料的微观结构，在观察之前用铂进行溅射涂覆试样。并用Mod550i型电制冷能谱仪(EDS)对二氧化硅表面锌和铽元素的含量进行半定量分析。

2.3.4 材料比表面积分析

采用JW-BK22型比表面分析仪(BET)，在80 K下记录抗菌硅胶对N2吸附-解吸等温线，分析了掺杂稀土前后材料的比表面积变化情况。

2.3.5 抗菌性能检测

本文采用涂布平板法对材料的抗菌性能进行检测，选用大肠杆菌为实验菌种(革兰氏阴性菌E.coli，型号为BL21，保藏编号：CCTCC AB 204033)，用LB琼脂培养基进行涂板。将大肠杆菌接种到LB液体培养基中，培养至对数生长期，然后将菌液用缓冲液稀释至CFU为5.5×106个/mL。称量不同质量的抗菌粉体材料倒入装有蒸馏水的试管中，然后将稀释后的菌液量取100 μL依次装进试管中，摇均匀后放入恒温摇床上振荡，将振荡完的液体用移液枪量取100 μL到培养皿中，用涂布棒涂抹均匀，将涂好的培养皿放入37 ℃的恒温培养箱中培养18～24 h，做菌落计数并计算其杀菌率。

3 结果与讨论

3.1 响应曲面法优化制备条件

实验以A(Zn2+浓度)、B(pH)和C(Tb3+浓度)此3个单因素为自变量，以锌型复合抗菌材料的Y(抗菌率)为响应值，通过Design-Expert 10软件中Box-Behnken Design(BBD)法进行3因素3水平的设计。

3.1.1 方案设计与抗菌检测结果分析

基于单因素实验结果，选择和设计的单因素优化范围，具体设计因素水平如表1所示。

表1 BBD设计因素水平Table 1 Factors and levels for BBD

表2为响应曲面法实验条件设计及结果，通过BBD软件对实验进行组合设计，得到17组交叉试验条件，按其条件制备锌型复合无机抗菌材料并进行抗菌性能检测，得到17个样品的抑菌率，如表2所示。

表3为多项式回归模型方差关于响应值(Y)的分析，通过分析结果评估拟合的显著性和模型的可信性[10]，其中P-value可以判定模型的可信度及响应值的显著性，P-value≤0.05说明模型具有高可信度，且P-value值越小对应的响应值越显著，由表3可知，模型中A(Zn2+浓度)、B(pH)、C(Tb3+浓度)和AC(Zn2+浓度和Tb3+浓度的交互作用)都显著。F-value为35.74，表明实验模拟设计效果显著，可信度较高。关于响应值Y的相关系数R2(0.9789)接近于1，表明模型预测值和实验值拟合度和相关性较高。鉴于以上分析，实验模型拟合度较好，误差小，此模型可用于预测锌型复合无机抗菌材料的抗菌率。

表2 响应曲面法实验设计及结果Table 2 Experimental design matrix and results

表3 材料抗菌率拟合模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance results of Material antibacterial rate mathematical model

3.1.2 两因素交互作用对材料抗菌率的影响

为了进一步研究两因素间的交互作用和确定最优点，利用Design Expert软件对回归模型进行响应面分析，得到相应的等高线图(2D)和响应面立体分析图(3D)，如图1、图2、图3所示。

如图1(a)和图1(b)显示了A(Zn2+浓度)和B(pH)对Y(抗菌率)的影响。从图1(a)可以看出，等高线均匀分布且呈椭圆状，说明Zn2+浓度和pH的交互作用对材料抗菌率的影响较为显著。从图1(b)可知，在Zn2+浓度和pH值交汇曲面的最高点处，材料的抗菌率达到最高，且靠近Zn2+浓度的曲面斜率要高于靠近pH值的曲面斜率，说明Zn2+浓度对材料抗菌率的影响大于pH值的影响。该分析与表3方差分析进行对比，表中A的Prob>F的值(0.0001)小于B的Prob>F值(0.0017)，表明Zn2+浓度对材料抗菌率的影响要比pH值显著，与响应面分析相一致。Zn2+浓度对应的曲面呈半弧形，说明随着Zn2+离子浓度增大，材料抗菌率呈先升高后趋于平稳的趋势，因为锌元素作为主要的有效抗菌成分，随着Zn2+浓度增加，Zn2+负载量也随之增加，因此材料抗菌率呈先上升后趋于平稳的趋势。pH值对应的曲面呈“拱桥”形，说明制备材料时pH值不能过高和过低，当pH值为9左右材料抗菌率最高，因为当处于酸性或强碱性的体系中，锌以离子的形式存在，在反应过程中不利于ZnO生长[11]，而材料中主要的抗菌成分为ZnO，因此在制备过程中要控制好体系的pH值。

图1 Zn2+浓度和pH交互作用对材料抗菌率的影响(a)2D模拟图；(b)3D模拟图Fig.1 Effect of Zn2+ concentration and amount of pH on bacteriostatic rate of materials(a)2D diagram; (b)3D diagram

图2 Zn2+浓度和Tb3+交互作用对材料抗菌率的影响(a)2D模拟图；(b)3D模拟图Fig.2 Effect of Zn2+ concentration and amount of Tb3+ on bacteriostatic rate of materials(a)2D diagram;(b)3D diagram

图2(a)和图2(b)显示了A(Zn2+浓度)和C(Tb3+浓度)对Y(抗菌率)的影响。图2(a)中，等高线在Zn2+浓度坐标一侧较为密集且呈椭圆状，说明Zn2+浓度比Tb3+浓度对材料抗菌率的影响更显著。图2(b)中靠近Zn2+浓度的曲面斜率大于Tb3+浓度的曲面斜率，说明Zn2+浓度对材料杀菌率的影响大于Tb3+浓度。该分析与表3中A的Prob>F值(0.0001)小于C的Prob>F值(0.0040)的解释相一致。图2(b)中两曲面均呈半弧状，说明随着Zn2+浓度和Tb3+浓度增加，材料抗菌率均呈上升趋势，因为材料中Zn2+为主要抗菌成分，Tb3+作为一种添加剂，起到协同抗菌的作用，因此随着Zn2+、Tb3+浓度增加，Zn2+负载量呈上升趋势，直到接近饱和，因此材料的抗菌率呈先上升后趋于平稳的趋势。但考虑到制备成本问题，添加Zn2+浓度和Tb3+浓度可在0.3 mol/L和0.013 mol/L左右。

图3(a)和图3(b)显示了B(pH)和C(Tb3+浓度)对Y(抗菌率)的影响。图3(a)中，等高线在pH值坐标一侧较为密集且椭圆状，说明pH值比Tb3+浓度对材料抗菌率的影响更显著。图3(b)中靠近pH浓度的曲面斜率大于Tb3+浓度的曲面斜率，说明pH浓度对材料杀菌率的影响大于Tb3+浓度。该分析与表3中B的Prob>F值(0.0017)小于C的Prob>F值(0.0040)的解释相一致。图3(b)中pH值对应的曲面呈“拱桥”形，说明在pH值与Tb3+浓度的交互实验中，pH值不能太大和太小，应该保持pH值在9左右，才能有效提高材料的抗菌性能。

综上所述，Zn2+浓度、pH值、Tb3+浓度对材料抗菌率均有影响，每个因素间的相互作用对材料抗菌率显示出了不同影响程度。结合图表数据，3个因素对材料抗菌率的影响大小分别为：Zn2+浓度>pH值>Tb3+浓度；且Zn2+浓度和Tb3+浓度交互作用对材料抗菌率影响最为显著。

图3 pH和Tb3+交互作用对材料抗菌率的影响(a)2D模拟图；(b)3D模拟图Fig.3 Effect of Ph and amount of Tb3+ concentration on bacteriostatic rate of materials(a)2D diagram; (b)3D diagram

3.1.3 响应曲面优化结果验证

设定材料抗菌率达最大值时，为材料制备的最优条件，通过软件Design-Expert进行优化分析，得到最优条件如表4所示。根据该预测条件，制备出最优样，以大肠杆菌为菌种进行抗菌性能检测。从表4可知，以优化条件制备出的锌型复合无机抗菌材料，抗菌率为97%，与实验模拟值相差较小，计算相对平均偏差为0.414%，在正常误差范围内，再结合3.1.2中响应面分析，表明模型拟合度和可信度较高。故当Zn2+浓度为0.3 mol/L，pH为9,Tb3+浓度为0.01 mol/L时，锌型复合无机抗菌材料有较佳的经济效益和抗菌性能。

表4 验证实验条件Table 4 Verify the experimental conditions

3.2 材料形态分析

利用X射线衍射仪(XRD)在2θ为10°～80°范围内，对材料的形态进行表征，其结果如图所示。

如图4中分别为纯二氧化硅和锌-铽二氧化硅的XRD图。由图可知，纯二氧化硅在衍射角度(2θ)为16°～32°处出现一个包峰，没有其他晶形特征峰，证明二氧化硅载体为无定型态。锌-铽二氧化硅的XRD图中，在2θ为31.6、34.5、36.4、47.5、56.6、62.9、66.3、67.8、69.1、72.6、77.0出现的衍射峰，分别对应于ZnO晶体(100)，(002)，(101)，(102)，(110)，(103)，(200)，(112)，(201)，(004)和(202)晶面的衍射峰，属于六方纤锌矿结构[12-13]。但是在图中没有发现TbOx的相关衍射峰，TbOx的量可能低于XRD的检测限。即该抗菌材料的载体二氧化硅为无定型态，其中负载的锌是以六方纤锌矿结构的ZnO形态存在，说明该材料中ZnO为主要抗菌成分。

3.3 分子结构分析

实验通过傅里叶红外光谱图(FTIR)，对纯二氧化硅和锌-铽二氧化硅各基团振动频率的变化情况进行表征比较，检测结果如图5所示。

图5为二氧化硅和锌-铽二氧化硅红外谱图，由图可知，1099 cm-1附近较强的吸收峰属于Si-O-Si反对称伸缩振动峰，950 cm-1附近较弱的峰是Si-OH的弯曲振动吸收峰，800 cm-1、468 cm-1附近的峰为O-Si-O键对称伸缩振动峰，这四个吸收峰一起组成二氧化硅的特征吸收峰。3440 cm-1处有一个较宽的吸收峰，属于结构水-OH反对称伸缩振动吸收峰，1635 cm-1附近的吸收峰属于水的H-O-H弯曲振动峰，1384 cm-1附近的吸收峰属于O-H的变形震动[14-15]。从锌-铽二氧化硅红外谱图可知，与二氧化硅红外谱图相比，掺杂锌和铽后的二氧化硅，在950 cm-1附近的Si-OH弯曲振动吸收峰消失，其他对应的峰形没有太大的改变。因为锌-铽二氧化硅在制备过程中，要经过300 ℃的煅烧，在煅烧过程中Si-OH缩合成Si-O-Si键，因此谱图中没有Si-OH弯曲振动吸收峰。总体而言，二氧化硅在添加少量的Zn2+和Tb3+后，其分子的结构和化学键并未发生实质性变化，不会影响二氧化硅原有的性能，因此二氧化硅可应用的领域，锌-铽二氧化硅也一样适用。

图4 锌型复合无机抗菌材料XRD图Fig.4 XRD patterns of zinc composite inorganic antibacterial material

图5 锌型复合无机抗菌材料的FTIR谱图Fig.5 FTIR patterns of inc composite inorganic antibacterial material

3.4 材料形貌分析

本文通过SEM对锌型复合无机抗菌材料的形貌进行表征，用EDS对材料表面元素成分和含量进行检测，结果如图6所示。

图6 锌型复合无机抗菌材料的SEM检测图，(a，b)不同放大倍数下的SEM图，(c)图b中的能谱图Fig.6 SEM image of zinc composite inorganic antibacterial material，(a,b)SEM images of sample under different magnifications, (c)EDS pattern of corresponding to the SEM image of(b)

图6(a)和6(b)为锌型复合无机抗菌材料在不同放大倍数下的扫描电镜照片，图6(c)为选取扫描区域内点扫描的EDS半定量分析结果。由图6(a)可知，锌型复合无机抗菌材料呈不规则的颗粒状，结构蓬松，平均粒径较小。从图6(b)可知，在二氧化硅载体表面，氧化锌主要以无规则的絮状和花瓣状生长，该结构有利于增加氧化锌晶型的缺陷程度，从而增加氧化锌晶型结构中的氧空位和空穴程度，促进了活性氧的产生，提高材料的抗菌性能[16]。从图6(c)可知，材料主要由O、Na、Si、Au、Tb、Zn元素组成(Na来自提供硅原的Na2SiO3，Au来自检测样品时的喷金处理)，其中锌元素的含量相对较高，质量比为16.96%，铽元素的含量相对于锌元素较低，其质量比为1.34%，符合制备材料时添加的元素配比。

3.5 材料比表面积分析

为了对比添加铽元素前后锌型无机抗菌材料的比表面积变化情况，对纯二氧化硅、单载锌二氧化硅和锌-铽二氧化硅进行了进行BET检测，结果如图7所示。

图7 锌复合无机抗菌材料的氮气吸附脱附等温线Fig.7 Material nitrogen isotherm analysis of zinc composite inorganic antibacterial

图7分别为纯二氧化硅、单载锌二氧化硅和锌-铽二氧化硅的氮气吸附脱附等温曲线，从图中可以看出各等温曲线均呈IV型等温线(H3型磁滞回线)，材料对氮气的吸附和脱附均分开进行，说明该材料属于介孔材料。其中纯二氧化硅、单载锌二氧化硅和锌-铽二氧化硅的比表面积分别为82.8 m2/g、187.4 m2/g和236.0 m2/g，由此说明负载氧化锌后二氧化硅的比表面积增加的较大，因为氧化锌在二氧化硅的孔隙内和表面呈絮状和花瓣状生长，使二氧化硅的孔隙内部和表面更加粗糙，从而扩大了二氧化硅比表面积。当掺杂铽元素后，材料的比表面积大于单独载氧化锌的比表面积，据介绍，将金属离子与锌共掺杂能使氧化锌结晶度降低，增加晶型缺陷程度，氧化锌晶面暴露更多[17-20]。因此初步推测，稀土铽和锌共掺杂能够增加氧化锌的缺陷程度，使氧化锌晶面暴露增大，增加锌离子溶出和促进活性氧的产生，同时也增加了材料与细菌的有效接触面积，从而提高材料的抗菌性能。

3.6 抗菌性能检测

3.6.1 抗菌活性

为了考察锌型复合无机抗菌材料的抗菌性能，采用涂布平板法，对在较佳条件下制备出的纯二氧化硅、单载铽二氧化硅、单载锌二氧化硅和锌-铽二氧化硅进行了抗菌检测，检测结果如图8所示。

图8 抗菌性能检测图(a)对照组，(b)纯二氧化硅，(c)铽-二氧化硅，(d)锌-二氧化硅，(e)锌-铽二氧化硅Fig.8 Image of material antibacterial performance test(a)blank，(b)silica，(c)Tb-silica，(d)Zn-silica，(e)Zn-Tb-silica

图9 不同浓度锌型复合无机抗菌材料杀菌作用图Fig.9 Bactericidal effect of zinc-based composite inorganic antibacterial materials with different concentrations

图8中(a)空白样，(b)纯二氧化硅的抗菌图，(c)单载铽型二氧化硅的抗菌图，(d)单载锌型二氧化硅的抗菌图，(e)锌-铽二氧化硅的抗菌图。由各图比较可知，纯二氧化硅和单载铽型二氧化硅并没有杀菌性能；单独载锌的二氧化硅杀菌性能较低，杀菌率约为76%；而锌-铽二氧化硅的抗菌性能较好，杀菌率达到97%。因此，可以看出单载锌的二氧化硅抗菌性较弱，微量的稀土铽没有抗菌性，当锌和铽共掺杂时，锌-铽二氧化硅具有优异的抗菌性能，说明在载锌型二氧化硅中添加微量稀土铽，能有效提升材料的抗菌性能，稀土铽对材料具有协同抗菌作用。

3.6.2 最小杀菌浓度

本文以大肠杆菌为实验菌种，来检测掺杂稀土铽对材料最小杀菌浓度的影响，将大肠杆菌培养至对数生长期，用缓冲溶液稀释至CFU为5.5×106个/mL，分别称取2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4 g/L、4.5 g/L、5 g/L、5.5 g/L和6 g/L粉体材料，进行抗菌检测[21]，结果如图9。

如图9可知，随着材料的浓度升高，大肠杆菌的菌落数逐渐减少，当材料浓度为5.5 g/L时，掺杂铽后的锌型复合无机抗菌材料的抗菌率达到99.9%，即5.5 g/L为该材料的最小杀菌浓度，而在此浓度下未掺杂铽的锌型抗菌材料的抗菌率为91%。由此说明，掺杂稀土铽能有效提高锌型抗菌材料的抗菌性能。

综上所述，该锌型复合无机抗菌材料中，锌以纤锌矿结构的氧化锌存在，呈絮状和花瓣状生长，掺杂稀土铽元素后材料的比表面积明显增大，使氧化锌晶面暴露增大，增加锌离子溶出和促进活性氧的产生，同时也提高了材料与细菌的有效接触面积，因此材料抗菌性显著提高。