HPLC-MS/MS法在白血病患者血浆维生素C水平测定中的临床应用*

孙文利，王欣俞，田文君，李明花，陈佳琦，王 磊，张建平，刘红星△

(1.河北燕达陆道培医院，河北廊坊 065201；2.河北燕达医院检验科，河北廊坊 065201；3.山东省立医院临床检验医学部，山东济南 250021)

维生素C又称抗坏血酸，用于治疗抗坏血病。人类自身不能合成维生素C，只能通过食用新鲜的蔬菜、水果及药物等途径获得。维生素C是一种高效的抗氧化剂，大量文献研究报道维生素C在抵御癌症上起着重要的作用，其作用机制是维生素C可以阻断致癌物N-亚硝基化合物合成，预防癌症[1-5]；还可以通过清除氧自由基保护细胞免受损伤及对肿瘤细胞的杀伤作用[6]。维生素C能用来靶向并且杀灭癌症干细胞[7]，增加人体食用维生素C可以降低人们肺癌风险[8]，高水平的维生素C可以有效抑制携带KRAS和BRAF突变基因的恶性结直肠癌[9]。此外，越来越多的证据表明维生素C可以促进造血干细胞死亡，用于治疗白血病[10]。LIU等[11]研究发现，维生素C会增强地西他滨(5-aza-2′-deoxycytidine)的抗肿瘤作用，推测维生素C对某些恶性血液肿瘤治疗有辅助效果；砷剂联合维生素C治疗急性早幼粒细胞白血病具有良好的临床疗效[12]；此外，在部分白血病患者中存在TET2基因突变，促进白血病干细胞分化为成熟的最终会死亡的血细胞，CIMMINO等[13]研究证明维生素C具有激活TET2的功能从而用于白血病的治疗。未服用维生素C制剂的白血病患者严重缺乏维生素C(血清维生素C<11.4 μmol/L)[11]，因此，对于血液病患者，适当补充维生素C有一定治疗意义。目前，测定血液病患者体内维生素C水平的文献较少，且国内多采用高效液相色谱法测定维生素C水平[14-17]，本文建立了快速的、灵敏的、准确的超高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法，用于测定血液病患者血浆中维生素C的水平，为临床上白血病患者营养及治疗上提供参考依据。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 主要仪器包括Qtrap 4000离子阱检测器(美国AB公司)，岛津HPLC 20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，色谱化学工作站(美国AB公司)，Vortex-Genie2 涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)，全自动高速冷冻离心机(Thermo Fisher)，电子天平(瑞士Sartorius公司)。试剂包括维生素C标准品(批号：6-EOD-174-1，规格：100 mg)，L-Ascorbic Acid-1-13C标准品(内标，批号：4-DXX-93-1，规格：5 mg)，均购自Toronto Research Chemicals Canada；甲醇为色谱纯(Thermo Fisher)，水为超纯水(屈臣氏蒸馏水)，偏磷酸(批号：K11871，规格：500 mg，含量99%)为分析纯，购自山东西亚化学工业有限公司，甲酸为色谱纯，乙酸铵为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱与质谱条件 (1)色谱条件。色谱柱XBridge®C18(4.6 mm×50.0 mm，5 μm)(Waters，Made in Ireland)，流动相A：0.1%甲酸的甲醇溶液，流动相B：2 mMol/L乙酸铵-0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱(0.01～0.5 min，50%B→95%B；0.5～1 min，95%B保持0.5 min；1～1.5 min，95%B→50%B；1.5～2 min，50%B保持0.5 min)，流速为0.8 mL/min，柱温60 ℃，进样量10 μL。(2)质谱条件。采用电喷雾离子源(ESI)；以多重反应监测方式(MRM)扫描，负离子方式检测；离子喷射电压(IS)：4 500 V；离子源温度(TEM)：450 ℃；源内气体1(GS1，N2)压力：55，气体2(GS2，N2)压力：55 V；Curtain gas：20；碰撞气压力：Medium；去簇电压(DP)电压：90V；碰撞能量(CE)20 V；入口电压10 V；出口电压15 V；用于定量分析离子对175.0→115.1(维生素C)，176.0→115.8(内标L-Ascorbic Acid-1-13C)。

1.2.2溶液制备 (1)精密称取维生素C标准品10 mg，用10%的偏磷酸溶液定容至10 mL，摇匀，得到浓度为1mg/mL的维生素C储备液，再用偏磷酸将其稀释，配制成所需质量浓度的维生素C标准溶液，放置-20 ℃冰箱保存，备用。(2)精密称取内标L-Ascorbic Acid-1-13C标准品5 mg，用10%的偏磷酸溶液定容至10 mL，摇匀，得到浓度为0.5 mg/mL的内标储备液，再用偏磷酸将其稀释，配制成质量浓度为10 μg/mL的内标溶液，备用。

1.2.3受试者选择 随机选取河北燕达陆道培医院及山东省立医院的白血病患者123例，男76例，女47例，年龄1～60岁。同时选取407名健康志愿者，男59例，女348例，年龄21～53岁。受试者均知情同意。

1.2.4血浆样品处理

1.2.4.1标准曲线样品处理 取20 μL相应质量浓度的标准溶液，加180 μL空白血浆，加入500 μL含有10 μg/mL内标溶液的10%偏磷酸溶液，涡旋混合1 min，13 000 r/min离心8 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤后进样分析。

1.2.4.2待测血浆样品处理 取200 μL待测血浆样品，加入500 μL含有10 μg/mL内标溶液的10%偏磷酸溶液，涡旋混合1 min，13 000 r/min离心8 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤后进样分析。

1.2.5方法学考察

1.2.5.1专属性 取空白血浆200 μL，按“1.2.4.2”项下处理(不含内标)；在空白血浆中加入一定量的维生素C及内标L-Ascorbic Acid-1-13C的标准溶液，同样按“1.2.4.2”项下处理；取患者血浆样品，按同样的方法处理，进样分析，考察方法的专属性。

1.2.5.2标准曲线及定量下线 取空白血浆180 μL，分别加入20 μL相应质量浓度的标准溶液，配制成相当于维生素C质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的血浆样品，按“1.2.4.1”项下条件处理，以维生素C与内标峰面积之比(Y)作纵坐标，以血浆维生素C浓度(X)为横坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘进行线性方程回归分析。

1.2.5.3精密度与回收率试验 取空白血浆及维生素C标准溶液适量，配置成浓度为1、25、40 μg/mL的质量控制(QC)样品，按“1.2.4.2”项下条件进行操作，每一浓度测定5个样本分析，连续测定3 d，用当日的标准曲线测定QC样品质量浓度，计算出回收率、日内及日间精密度。

1.2.5.4稳定性 随机选取6例本院健康职工血浆样本，分别考察维生素C在血浆样品中放置室温0、1、2、4、6 h的稳定性，按“1.2.4.2”项下条件进行操作。

1.2.5.5临床应用 对选取的123例白血病患者及407名健康志愿者，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采血，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，按“1.2.4.2”项条件进行处理，进行样本测定分析。同时取本院407名健康志愿者血浆，均未服用维生素C药物，按同样的方法进行处理测定。

1.3统计学处理 采用SPSS18.0对患者和健康志愿者两组检测结果进行统计学分析，采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1维生素C及内标的质谱图 见图1。

图1 维生素C(A)、内标L-Ascorbic Acid-1-13C(B)二级扫描质谱图

2.2方法学的考察

2.2.1专属性 维生素C及内标L-Ascorbic Acid-1-13C的测定均不受内源性物质的干扰，专属性良好。典型色谱图见图2。

注：A表示空白血浆；B表示空白血浆+维生素C+内标L-Ascorbic Acid-1-13C；C表示患者血浆样品

图2维生素C和L-Ascorbic Acid-1-13C色谱图

2.2.2标准曲线及定量下线 回归方程为Y=0.098 3X+0.002 78，r=0.994 2。结果表明，血浆中维生素C质量浓度在0.5～50.0 μg/mL内线性关系良好，其定量下线为0.1 μg/mL。

2.2.3精密度与回收率试验 日内及日间相对标准偏差均小于5%，方法回收率在90%～110%，见表1。

表1 精密度及回收率结果

2.2.4稳定性 6例标本随着在室温放置时间的延长，血浆中维生素C的水平逐渐下降，4例标本在放置4 h时维生素C质量浓度已降至初始质量浓度80%，6 h时几乎全部降至80%以下，甚至降至初始质量浓度的一半。见图3。

图3 维生素C血浆样本在室温的稳定性(n=6)

2.2.5临床应用 测得患者及志愿者血浆中维生素C的浓度并分析其分布情况，见表2、图4、5(比例分布)。80%白血病患者血浆中维生素C浓度在2 μg/mL以下，10%的患者血浆中维生素C浓度在2～<4 μg/mL，仅有10%的患者在4 μg/mL以上；而志愿者血浆中维生素C平均浓度为(8.8±3.0)μg/mL，92%均在4～15 μg/mL范围内，两组结果比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 维生素C的质量浓度测定结果(n=530)

图4 血浆中维生素C浓度结果散点图(n=530)

注：白血病患者体内维生素C浓度在4～15 μg/mL为正常，2～<4 μg/mL为水平不足，1～<2 μg/mL为缺乏，低于1 μg/mL为严重不足

图5白血病患者血浆中维生素C浓度结果分布图(n=123)

3 讨 论

维生素C具有烯醇式己糖内酯立体结构，其烯醇式羟基极易解离出H+，具有有机酸的性质，遇到空气中氧、热、光、碱性物质及金属离子存在时易氧化分解，为增加维生素C的稳定性，在溶液的配制及样品前处理均采用10%的偏磷酸作为溶剂及沉淀剂[17]。目前关于人血浆中维生素C浓度的测定，大多采用HPLC法[14-17]，一般容易受到其他物质的干扰，且分析时间较长(>10 min)，本文建立了一种快速、灵敏、专属性强的适合测定人体血浆中维生素C的HPLC-MS/MS方法，分析时间短(2.0 min)，在内标的选择上，比较了L-Ascorbic Acid-1-13C和左旋多巴，综合考虑保留时间、响应值后，选择L-Ascorbic Acid-1-13C作为维生素C浓度测定内标物。实验采用室温放置24 h的血浆作为空白血浆，排除了内源性维生素C的干扰[18]，且通过实验验证空白血浆中维生素C水平低于方法的定量下线。为避免维生素C的快速降解，且为了满足本院临床标本的检测，本文仅对血浆中维生素C在室温条件下的稳定性进行了考察，维生素C浓度呈直线下降，建议临床在采血后尽快送检(2 h内)，最长不超过4 h，维生素C在其他条件下的稳定性还需进一步进行考察。该方法作为维生素C水平测定的分析方法，为患者在营养学评价及生理病理条件下提供临床意义。

健康人血浆中维生素C浓度在4～15 μg/mL(正常范围26～84 μmol/L)，2～<4 μg/mL为维生素C水平不足，低于2 μg/mL为维生素C缺乏，低于1 μg/mL时有可能引起坏血病[11,17,19-20]。测定的123份白血病患者样本中，维生素C水平在2 μg/mL以下的占总数的80%，仅有12名患者血浆中维生素C水平在4 μg/mL以上，而健康志愿者血浆中维生素C浓度几乎全在4～15 μg/mL，同时对结果偏低的健康志愿者进行了膳食调查，有志愿者处于哺乳或怀孕阶段，推测这可能是导致维生素C浓度过低的原因之一，当生理状况发生改变时应注意维生素C的变化，此外有两名志愿者有8年以上的吸烟史，有研究称吸烟会导致体内维生素C的减少[20-21]，所以应该减少吸烟。同时对530例样本检测结果做了散点图(图4)，图中显示志愿者维生素C浓度明显高于白血病患者(P<0.01)，从而充分说明患者体内维生素C总体水平偏低，大多数白血病患者饮食上可能比较单一，导致其体内缺乏维生素C。

4 结 论

已有实验证明，维生素C可以提高白血病患者的免疫力、诱导白血病细胞凋亡[12,22]，本实验结果也为维生素C在白血病治疗上的作用提供参考依据，因此对于白血病患者应适当多食用新鲜水果、蔬菜或维生素C制剂来补充维生素C，为其临床治疗提供帮助。