金钱鱼Zar1基因克隆及其表达分析

何飞祥，江东能，陈华谱，邓思平，吴天利，田昌绪，石红娟，朱春华，李广丽

（广东海洋大学水产学院//南海水产经济动物增养殖广东省普通高校重点实验室 // 广东省名特优鱼类生殖调控与繁育工程技术研究中心 // 湛江市海洋生态与养殖环境重点实验室，广东 湛江 524088）

脊椎动物受精和早期胚胎发育过程中存在卵母细胞特异的母源效应基因（Maternal effect gene，MEG），此类基因通常特异表达于卵巢组织及卵母细胞中。其在母体型向合子型调控的过渡期发挥重要功能，该转录表达调控过渡称为母体-合子转变或卵子-合子转变（Maternal-zygotic transition, MZT）。至今，已在脊椎动物中鉴定出多种母源效应基因，包括Dnmt1、Gdf9、Bmp15、Mater、Zar1、Hsf1、Nalp5、Nalp9、Stella、Brg1、Nmp2、Fmn2、Basonuclin和Zfp36l2[1-3]。合子阻滞因子1（Zygote arrest 1，Zar1）是第一个在人和小鼠中发现的卵子-合子转变中起关键作用的母源效应基因[4]。目前已在斑马鱼[3]、红鳍东方鲀[5]、虹鳟[6]等鱼类中开展了Zar1克隆和表达分析。Zar1在不同物种中的组织表达模式不同，主要表达于性腺和胚胎发育细胞中。小鼠Zar1在卵母细胞、1和2细胞期的胚胎中表达[4]；斑马鱼Zar1仅在卵巢中高表达，有着明显的卵巢特异性，在斑马鱼的卵母细胞和整个胚胎期均可检测到Zar1转录本，而在囊胚期后表达下降[3]。

雌性小鼠中纯合敲除Zar1，产生的卵子可正常受精而形成合子，但多数胚胎停留在1细胞期而无法受孕[4]。雌性斑马鱼中敲除Zar1后的突变体导致早期卵母细胞凋亡和性腺出现雄性化，发生由雌向雄的性别逆转，表明Zar1对于早期卵子发生的必需[7]。因此，Zar1作为卵巢特异表达的母源效应基因可能参与卵子发生和胚胎发育的调控过程。

金钱鱼（Scatophagus argus），隶属鲈形目（Perciformes）金钱鱼科（Scatophagidae）金钱鱼属（Scatophagus），广泛分布于印度洋到太平洋海域，是广盐性亚热带硬骨鱼[8]。它是一种具有观赏和食用价值的名贵海水经济鱼类。但是金钱鱼的卵巢成熟比精巢晚，雌雄发育不同步，这导致其人工繁殖困难[9-10]。目前，在金钱鱼的雌雄鱼性别决定及其分化，以及生殖发育相关基因的调控方面已有较多研究报道[11-14]，而对于金钱鱼在发育成熟之前的卵母细胞所特异的母源效应基因的研究鲜见报道。本研究通过克隆金钱鱼Zar1基因，分析该基因在各组织中的表达情况，以及它们在不同性腺发育时期和胚胎发育过程中的表达模式，为Zar1在金钱鱼生殖发育过程中的生理功能研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

金钱鱼成鱼购自广东省湛江市东风水产品批发市场，体质量 200 ～ 350 g，体长 16.0 ～ 22.6 cm。挑取健康的性发育成熟个体，剖取心脏、肝、脾、胃、肾、鳃、肌肉、肠、下丘脑、垂体和性腺组织于液氮中速冻，移至-80 ℃超低温冰箱保存，用于RNA提取及基因克隆、组织表达研究。另取部分卵巢组织用于其发育时期确定，雌鱼每发育时期各取3尾，作为平行对照。不同发育时间胚胎样本，从受精卵至出膜每1 h取样1次，共对13个时间点取样，每个时间点平行取样3个，每个样本各取20枚胚胎混合，受精卵或胚胎样品采集时用DEPC（Sigma公司）水冲洗干净。胚胎样本为实验室保存[15]。

1.2 总RNA提取和cDNA合成

采用Trizol试剂盒（Invitrogen）按参考说明书提取性腺总RNA。用10 mg/mL的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白测定仪（Thermo Scientific）检测提取RNA浓度和纯度，-80 ℃保存以备用。然后以1 μg RNA为模板，按照 Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）说明书进行逆转录合成cDNA。

1.3 金钱鱼Zar1基因克隆和序列分析

从 NCBI数据库中下载大黄鱼（Larimichthys crocea）、欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的Zar1mRNA序列，将序列与本实验室金钱鱼转录组数据库进行生物信息学比对分析[16]，找到金钱鱼Zar1可能转录本，进而分别设计引物，引物由上海生工生物技术公司合成（表1）根据得到的金钱鱼Zar1序列分别设计引物，引物由上海生工生物技术公司合成。采用2×PCR MIX试剂（东盛生物科技公司）进行基因序列PCR扩增。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的片段用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化（N1072，东盛生物科技公司）。纯化片段连接到 Peasy-T3载体（CT301，北京全式金生物技术有限公司）进行亚克隆，连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞，用含氨苄的固体培养基于37 ℃条件下培养箱中培养12 h。筛选阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序。使用ORF Finder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线预测金钱鱼Zar1的开放阅读框（ORF），并利用EditSeq软件翻译其对应氨基酸序列。使用SMART（http://smart.embl－heidelberg.de/smart/）对蛋白结构和功能进行预测分析。利用Lasergene v 7.1.0软件进行蛋白序列多重比对和同源性分析。使用 Clustal X1.83和Mega 6.0软件用邻接法构建系统进化树。

1.4 逆转录PCR

取金钱鱼各组织及卵巢不同发育时期的cDNA作为模板，采用逆转录PCR（Reverse transcription PCR, RT-PCR）方法检测金钱鱼Zar1基因在雌雄鱼各个组织及其不同发育时期卵巢的表达。β-actin基因作为内参，引物如表1所示。用2×PCR MIX（东盛生物科技公司）在C1000TM Thermal Cycler（Bio Rad，美国）PCR仪上进行扩增。反应程序：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增反应循环32次（β-actin循环28次）；72 ℃延伸10 min。PCR产物用20 mg/m L琼脂糖凝胶电泳检测，Tanon 2500R凝胶成像系统拍照。

表1 实验所用引物Table 1 Primers used in present research

1.5 实时荧光定量PCR（qPCR）检测

使用Zar1基因的特异性qPCR引物见表1，在Roche light CyclerTM 96实时荧光定量 PCR仪（Roche）上进行qPCR分析，检测Zar1在卵巢和胚胎不同发育时期的表达，以β-actin作为内参基因。参照试剂盒说明书 SYBR®Green Real Time PCR Master Mix (TOYOBO，QPK-201)进行，反应体系 20 μL 为：PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL（10 μmol/L），cDNA 模板 2 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共循环40次。运用2-ΔΔCt方法计算Zar1的相对表达量。

1.6 数据处理

数据结果采用平均值±标准差表示，各个时期使用3个平行样本。采用SPSS 19.0进行单因素方差分析和Duncan多重比较，显著性水平α= 0.05。

2 结果与分析

2.1 金钱鱼Zar1序列分析

克隆得到金钱鱼Zar1包含ORF的cDNA序列，ORF长为1 008 bp，编码335个氨基酸（Genbank登录号：MK736659）。利用在线数据库平台ExPASy分析 Zar1蛋白的理化特性，其蛋白分子量为 38 436.54，理论等电点为 9.72，蛋白质的不稳定指数为 41.94，疏水性平均值为-1.083，其脂溶系数为48.33。利用在线软件对 Zar1蛋白的二级结构进行预测（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），其氨基酸序列中α-螺旋占14.33%，β-转角占3.28%，延伸链及无规则卷曲各占14.33%、68.06%。

2.2 Zar1基因同源性分析

将金钱鱼Zar1氨基酸序列与人、小鼠、斑马鱼等其他物种蛋白进行多重序列比对发现（图1），Zar1氨基酸的C末端序列非常保守，具有非典型的PHD 基序（Plant homeo domain）。其具有保守的C12结构模式，即（C-X2-C-X10-C-X12-C-X2-C-X13-C-X2-C-X4-C-X1-C-X17- C-X2-C-X6-C）。金钱鱼 Zar1氨基酸序列中 236～321代表锌结合域（zinc-binding domain），该结合域属于一个具有多对CxxC基序的zf-3CxxC超家族成员，可能代表多个锌结合区，有着半胱氨酸与高度保守的组氨酸残基。将金钱鱼Zar1氨基酸序列与其他物种进行同源比对显示，金钱鱼Zar1与大黄鱼同源性最高，为85.1%，与小鼠同源性最低，为38.0%（表2）。另外，将金钱鱼Zar1氨基酸序列与其他脊椎物种的Zar1氨基酸序列进行邻接（neighbor-joining）聚类分析，构建系统进化树（图2）。发现金钱鱼与鲈形目的大黄鱼聚为一支，同源性较高，其亲缘关系最近。而与人、小鼠、斑马鱼和非洲爪蟾相分离，结果表明金钱鱼在进化上与鲈形目鱼类亲缘关系较近。

图1 金钱鱼Zar1与其他脊椎动物氨基酸序列的多重比对Fig.1 Comparison of Zar1 amino acid sequences between Scatophagus argus from other vertebrate

表2 金钱鱼Zar1与其他物种的同源性分析Table 2 Homology analysis of Scatophagus argus Zar1 with other species

图2 NJ法构建金钱鱼Zar1与其他脊椎动物的系统发生树Fig.2 Phylogenetic tree of Scatophagus argus Zar1 from other vertebrates based on NJ method

2.3 Zar1基因组织表达水平

通过RT-PCR方法分析Zar1在成年金钱鱼的心脏、肝脏、脾、胃、肾、鳃、肌肉、肠、下丘脑、垂体、性腺各个组织中的表达水平。对照组β-actin在雌雄所有组织中均扩增获得相似亮度的条带。Zar1仅在卵巢中强烈表达, 获得明显的特异扩增条带, 且扩增的片段长度与目的片段相一致，但未在其他组织中检测到特异扩增条带（图3）。结果说明金钱鱼Zar1基因具有卵巢特异性表达的特征

2.4 金钱鱼不同性腺发育时期Zar1基因表达水平

为进一步验证Zar1基因在金钱鱼卵巢不同发育时期的表达水平，本研究使用 RT-PCR和 qPCR对金钱鱼Zar1雌鱼II期、III期和IV期的卵巢进行表达定量分析（图4）。

结果显示，Zar1在卵巢中的表达呈现出显著递增的趋势，在 IV期卵巢中表达量达到最高。但 II期卵巢的相对表达量很微弱，与 IV期卵巢的表达水平形成显著差异（P＜0.05）。

图3 金钱鱼Zar1在不同组织中的表达水平Fig.3 Zar1 expression in tissue of Scatophagus argus

图4 金钱鱼Zar1在卵巢不同发育时期的表达水平Fig.4 Relative expression level of Zar1 at different ovary development stages in Scatophagus argus

2.5 Zar1在金钱鱼胚胎发育过程中的表达水平

金钱鱼Zar1在胚胎发育时期的表达结果显示，该基因在各个胚胎发育时期均有不同程度的表达（图5）。从整体胚胎发育时期来看，随着胚胎发育时期的变化，金钱鱼Zar1的表达水平出现逐渐递减的趋势。在受精后的前 5 h，即原肠胚期之前，其表达量维持在较高水平。其中，在受精后1 h达到最高表达，即四细胞期。在受精后 3～5 h，即原肠胚期有显微降低趋势。6 h之后，即眼囊形成期呈现显著的降低趋势。之后则逐渐降低，直到孵化期一直维持在相对较低表达。在受精后15 h，即孵化期达到最低水平。

图5 胚胎发育过程中金钱鱼Zar1的相对表达水平Fig.5 Relative expression level of Zar1 during embryonic development stages in Scatophagus argus

3 讨论

本研究通过克隆获得金钱鱼Zar1基因ORF全长1 008 bp，编码335个氨基酸。金钱鱼Zar1序列与其他物种进行同源性分析发现，金钱鱼Zar1与大多数鱼类的序列同源性较高，而与哺乳类和爬行类物种的序列同源性较低。系统进化树分析显示金钱鱼Zar1与大黄鱼紧密聚为一支，与其他鲈形目进化关系较为紧密，与传统分类地位一致。金钱鱼Zar1在C末端极其保守,具有非典型的PHD基序和锌指结构。其PHD基序具有保守的C12结构模式，即（C-X2-C-X10-C-X12-C-X2-C-X13-C-X2-C-X4-CX1-C-X17-C-X2-C-X6-C）。所有物种 Zar1的 PHD基序都是非典型的C12模式，而不是典型的C8模式[17]。研究表明，非典型的C12模式PHD基序在转录调控中参与了与其它蛋白的相互作用，此外Zar1的PHD基序同样含有锌指结构[18-19]。Zar1的非典型 PHD基序可能参与基因转录调控过程[20]。因此，本实验认为金钱鱼Zar1可能作为转录因子而发挥作用。

金钱鱼Zar1仅在金钱鱼卵巢中表达，表明金钱鱼Zar1是卵巢特异性表达基因。Zar1在有些物种也仅在卵巢中表达，如小鼠[5]、虹鳟[20]和斑马鱼[3]。而在有的物种中Zar1的组织表达范围较广，如Zar1在牛[21]、鸡[17]和蛙[5]的卵巢之外的其他组织中也表达，包括肌肉、心脏、精巢等。目前，Zar1在不同物种组织表达差异的机制尚不清楚，有待后续研究。

金钱鱼Zar1在卵巢各个时期均表达，且随着卵母细胞的成熟逐渐升高。在斑马鱼中，Zar1在П到 IV期卵巢表达量都维持在较高的表达水平[3]。非洲爪蟾Zar1在卵子发生各个阶段都表达，在卵子成熟过程稳定表达[22]。结果说明Zar1卵巢特异表达基因在卵子发育过程中发挥着重要作用。同时，分析Zar1在金钱鱼早期胚胎发育过程中的表达水平，发现Zar1在受精后早期显著表达，但在原肠胚期之后，出现逐渐降低的趋势。这与母源效应基因的表达特征相一致，即由母体向合子的过渡可以细分为两个过程，在转变前的母体基因表达量显著，而转变后，母体mRNA和蛋白质逐渐降解而合子的转录过程开始[23]。在斑马鱼[3]、小鼠[4]中，Zar1在囊胚期到原肠胚期表达量显著降低，之后保持在较低表达水平，非洲爪蟾Zar1的表达量在神经胚期明显下降[24]。由此可知，金钱鱼Zar1可能参与调节胚胎发育早期过程。

综上，金钱鱼Zar1作为一个重要的母源效应基因，具有在卵巢中特异性表达的特征。其在卵母细胞到胚胎的过渡过程中充当着重要角色，在卵子发育和胚胎发育过程中发挥着重要作用。