高产右旋糖苷酶微生物的筛选及产酶条件的优化

黄丽 孟继坤 周嫄 李树波 徐羽

摘要：使用营养缺陷型培养基、运用透明圈法从甘蔗土壤中筛得高产右旋糖苷酶的微生物SGC-2，根据菌株的形态和16S rDNA基因序列对其进行分析鉴定，并对其发酵产酶条件进行优化.结果表明，SGC-2为巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium），该菌株的适宜产酶条件为：右旋糖酐T2000质量浓度20 g/L，牛肉膏质量浓度10 g/L，NaCl质量浓度4 g/L，MgSO4质量浓度0.4 g/L，接种时间36 h，接种量3%，发酵时间96 h.该条件下，右旋糖苷酶酶活可高达28.32 U/mL，比优化前提高了151%.该右旋糖苷酶产生菌为首次报道，这为筛选高产右旋糖苷酶微生物的研究提供了一定的理论基础.

中图分类号：TS241文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.002

文章编号：2096-1553（2019）01-0011-10

关键词：右旋糖酐;右旋糖苷酶;巨大芽孢杆菌;发酵优化

0 引言

作为一种诱导酶，右旋糖苷酶可专一性水解右旋糖酐分子中的α-1，6 葡萄糖苷键，降解得到小分子的右旋糖酐、葡萄糖、异麦芽糖以及少量低聚糖等[1].右旋糖苷酶具有重要的应用价值.如在制糖工业中，右旋糖苷酶可以降解以右旋糖酐为主的多糖聚合物，从而降低产品黏度，减少蔗糖损耗，提高生产效率[2].在口腔疾病治疗方面，细菌多糖即右旋糖酐是牙菌斑的主要成分，右旋糖苷酶能够降低黏性多糖对牙齿表面的粘附性，从而对龋齿和牙周病的防治具有重要意义[3].在临床医学领域，右旋糖苷酶可以用于处理大分子右旋糖酐以制作代血浆，治疗失血性休克[4].

右旋糖苷酶在动物、植物和微生物中都普遍存在，真菌和细菌等微生物是其来源.其中，真菌是商品化右旋糖苷酶的主要来源，如淡紫拟青霉（Penicillium lilacinu）、绳状青霉（Penicillium funiculosum）、细丽毛壳菌（Chaetomium gracile）、淡黄青霉（Penicillium luteum）等[5-8].目前国内外报道可以生产右旋糖苷酶的细菌包括链球菌属（Streptococcus s）、黄杆菌（Flavobacterium sp）、嗜纤维菌（Cytophaga SP）、交替单胞菌（Altermonasespejiana）、交替假单胞菌（Pseudoalteromonas tetraodon）和氧化节杆菌（Arthrobacteroxydans）等[9-11].与真菌来源相比，细菌来源的右旋糖苷酶具有发酵时间较短、次生代谢产物少、分离纯化简便等优势，但其酶活力普遍较低.吴定涛等[12]从土壤筛选出一株棘孢青霉菌株，其产右旋糖苷酶的酶活力为75.6 U/mL.Mohamed等[13]报道的一株青霉-258产右旋糖酐酶的酶活力为41.8 U/mL.焦豫良等[11]从海泥筛选出的埃氏交替单胞菌A. espejiana YSN412，其右旋糖苷酶的酶活力仅为 9 U/mL.李卫娟等[14]发现的海洋细菌Arthrobacter oxydans KQ11在优化条件下产右旋糖苷酶的酶活力仅为4.697 U/mL.但以上研究仍存在发酵时间长或酶活性低等问题.鉴于此，本研究旨在筛选出一株细菌来源的高产右旋糖苷酶的菌株，对其进行分子生物学鉴定和产酶条件优化，为筛选高产右旋糖苷酶微生物的研究提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 样品

广西某糖厂甘蔗渣;某糖厂污水;甘蔗土样.

1.2 培养基

筛选培养基：右旋糖酐T2000，质量浓度10.0 g/L;蛋白胨，质量浓度5.0 g/L;氯化钠，质量浓度4.0 g/L;硫酸镁，质量浓度0.4 g/L;琼脂粉，质量浓度20.0 g/L;蒸馏水配制，pH值自然.

种子培养基：右旋糖酐T2000，质量浓度6.0 g/L;蛋白胨，质量浓度3.0 g/L;NaCl，质量浓度2.4 g/L;MgSO4，质量浓度0.24 g/L;蒸馏水配制，pH值自然.

液体发酵培养基： 右旋糖酐T2000，质量浓度10.0 g/L;蛋白胨，质量浓度5.0 g/L;NaCl，质量浓度4.0 g/L;MgSO4，质量浓度0.4 g/L;蒸馏水配制，pH值自然.

LB培养基：蛋白胨，质量浓度10 g/L;酵母膏，质量浓度5 g/L;NaCl，质量浓度10 g/L;蒸馏水配制， pH值自然.

以上培养基[15]均在115 ℃ 下湿热灭菌 30 min.

1.3 方法

1.3.1 菌株的筛选方法 首先，用无菌水对样品进行梯度稀释，选取合适的稀释度，涂布于筛选培养基平板上，于37 ℃温度下倒置培养3～6 d.方法1：用Simonson的快速透明圈法筛选出右旋糖苷酶产生菌株，即将无水乙醇倒入培养好的平板，置于冰箱中冷冻2 h后取出，凡在菌落周围出现透明圈的便是右旋糖苷酶产生菌.方法2：在长出菌落的平皿中倒入适量的革兰氏碘液，可快速观察到透明圈出现情况.

接着，挑取有透明圈的菌落进行划线纯化，于37 ℃下培养48 h后，获得单菌落并对其进行编号、保藏.将保藏菌株接入种子发酵培养基，于37 ℃下，200 r/min 培养24 h.按3%的接种量接入液体发酵培养基，于37 ℃下，200 r/min 培养96 h，10 000 r/min离心10 min取上清液測定酶活力大小.每个菌落设置3个平行试验，取平均值.筛选出酶活力高的菌株进行后续实验[16， 17].

1.3.2 菌株的遗传稳定性试验方法 用固体筛选培养基对高产右旋糖苷酶菌株进行传代培养，每隔24 h传代1次，于37 ℃下培养48 h.挑取菌株至种子培养基，于37 ℃下，200 r/min培养24 h;随后，按3%的接种量接种至发酵培养基中，于37 ℃下，200 r/min 培养96 h，10 000 r/min离心10 min取上清液测定酶活力大小.菌株发酵时设置3个平行试验，取平均值.依次传10代，在传代培养过程中，将测定OD600下菌株在发酵培养基中的生物量，并观察菌体细胞的形态及其菌落形态.

1.3.3 菌株的鉴定 形态学鉴定：在平板上划线接种产酶菌株，置于37 ℃下培养，观察并记录菌落形态、颜色等特征，在光学显微镜下观察菌株的个体形态，根据《伯杰细菌鉴定手册》[20]鉴定菌株的种属.

分子生物學鉴定：提取细菌基因组DNA，使用特异性引物扩增16S rDNA序列，扩增上游引物27F：5＼|AGAGTTTGATCCTGGCTAG＼|3，下游引物1429R;5＼|GGTTACCTTGTTACGACTT＼|3.

PCR扩增反应体系：正向引物与反向引物各1 μL，DNA模板8 μL， Prime STAR聚合酶10 μL，总计20 μL.

PCR扩增反应程序：98 ℃下变性10 min，98 ℃下变性0.5 min，55 ℃下退火0.5 min，72 ℃下延伸0.75 min，30 个循环，72 ℃下终延伸10 min，4 ℃下保存.

使用琼脂糖凝胶电泳分离纯化DNA，进行胶回收目的片段，将 PCR产物送至上海生物工程公司测序.将所得16S rDNA基因序列于GenBank数据库中已有的序列进行Blast分析，从GenBank中选择近缘菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA7.0软件程序的NJ比邻法构建系统发育树，以确定该菌株的分类学地位[15， 19].

1.3.4 发酵培养条件的优化 将筛选获得的菌株SGC-2进行产酶条件（如碳源、氮源、金属离子等）的优化.先测定菌株的生长曲线和发酵曲线，再优化其他产酶条件.碳源为蔗糖，右旋糖酐T2000，右旋糖酐T70，α-乳糖，葡萄糖，可溶性淀粉;碳源质量浓度分别为5 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L，30 g/L，35 g/L，40 g/L，45 g/L，50 g/L;氮源种类分别为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硝酸钠、尿素、氯化铵、硫酸铵（10.0 g/L）;氮源质量浓度分别为5 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L，30 g/L，35 g/L;NaCl质量浓度分别为0 g/L，4 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L，30 g/L;接种量分别为1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%;培养基装液量分别为30 mL，40 mL，50 mL，60 mL，70 mL，80 mL.以上均设置3个平行试验，取平均值.通过测定不同条件下酶活的变化情况，获得碳源种类、碳源浓度、氮源种类、氮源浓度、NaCl浓度、接种时间、接种量、装液量等发酵条件对产酶活力的影响.

1.3.5 酶活力的测定方法 右旋糖苷酶活力测定采用DNS比色法.具体操作如下：发酵液置于10 000 r/min离心10 min后，取上清液得粗酶液.取适当稀释后的粗酶液0.5 mL，加入到含有1.5 mL 3%右旋糖酐T70（缓冲液）的具塞刻度试管中，于45 ℃下水浴保温15 min，立即按DNS 法测定还原糖含量[18].

参照葡萄糖的标准曲线计算样品中的还原糖含量，最终计算出酶活力.酶活力单位（U/mL）定义：在上述反应条件下，每mL酶液在1 min内使底物降解生成 1 μmol葡萄糖所需的酶量.

2 结果与分析

2.1 产右旋糖苷酶微生物的筛选结果

2.1.1 初筛结果 各采样点样品稀释涂布划线培养筛选出产酶菌株情况如表1所示，产酶菌株初筛平板透明圈结果如图1所示.

由表1可知，使用酒精透明圈法可以筛选出产右旋糖酐酶产生菌，但将产透明圈菌株划线至筛选培养基时，菌株存活率相对低.其原因可能是由于酒精存贮时间太久而具有毒害作用和冷冻对菌种的影响，导致菌株划线培养时基本都不生长.而使用碘液法则可避免这种问题，即将革兰氏碘液倒入长出菌落的平板中，过30 s后培养基会染成深棕色，而右旋糖酐酶产生菌的周围便会有透明圈.这种方法不仅快速、便捷，且划线生长率也比酒精透明圈法高.

2.1.2 复筛结果 用透明圈法对全部菌株进行初筛和纯化培养，共获得存活的产透明圈菌株50株.将其接入液体发酵培养基，经37 ℃下，200 r/min培养6 d后，10 000 r/min离心取得上清液，测定酶活力，其中酶活力较高的菌株发酵复筛的结果见表2 .从表2复筛的结果可以看出，菌株SGC-2的酶活力最高为11.26 U/mL.

2.2 菌株的发酵遗传稳定性试验结果

传代培养过程中菌株的生物量及酶活变化如图2所示.由图2可知，从第1代至第10代菌液的生物量变化不大，菌株在平板上的菌落形态相同，在光学显微镜下观察传代过程中菌株细胞形态，其形态特征一致，无明显突变现象.经传代发酵培养，第1代至第10代的酶活相对稳定，均在11.2 U/mL左右，无明显下降现象.这说明菌株SGC-2具有稳定的遗传特性，可以选择其作为后续研究的试验菌株.

2.3 菌株鉴定结果

2.3.1 形态学鉴定结果 菌株SGC-2在筛选培养基上生长24 h后形成的菌落形态特征如图3所示.由图3a）可知，菌体呈圆形，黄褐色，边缘整齐，表面光滑，湿润.由图3b）可知，在显微镜下，菌体呈杆状，末端圆，大小约1.4 μm×3.5 μm，单个或呈短链排列，可运动.

2.3.2 分子学鉴定 利用16S rDNA 通用引物对菌株SGC-2基因组进行PCR扩增和电泳检测，凝胶电泳图如图4所示.由图4可知，在1500 bp处有一明亮的特征条带，琼脂糖凝胶胶回收纯化目标条带后，经上海生工生物有限公司测序，将所得16S rDNA基因序列与GenBank数据库中已有的序列进行Blast分析，从GenBank中选择近缘菌株的16S rDNA基因序列，经NCBI序列比对，菌株SGC-2与Bacillus megaterium strain（NR112636.1）巨大芽孢杆菌序列匹配度为100%.利用MEGA7.0软件和Cluster W软件，运用NJ比邻法对包括待鉴定菌株SGC-2在内的12株近缘模式菌株进行系统发育树构建，结果如图5所示.图5显示：菌株SGC-2与巨大芽孢杆菌进化亲缘关系高达90%，由此可鉴定SGC-2为巨大芽孢杆菌属.

2.4 发酵条件的优化试验结果

在基础发酵培养基上，对接种时间、培养基碳源和氮源、NaCl质量浓度、菌株接种量、培养基装液量进行优化，确定最优的发酵培养基配方.

2.4.1 接种时间与产酶发酵周期对产酶的影响

接种时间是影响菌株SGC-2生长的重要因素.

将菌株SGC-2接种到发酵培养基中，37 ℃ 下200 r/min振荡培养134 h，其间定时取发酵液，利用比浊法测定OD600值，绘制生长曲线见图6.

图6显示，在初始36 h内，菌株生长变化不明显，菌体增殖缓慢，生物量缓慢提升;当培养时间达到48 h以后，菌株进入对数期，菌体快速增殖，生物量急剧提高;96 h后进入稳定期，菌体总量达到峰值，继续延长培养时间至108 h以后，营养物质的消耗已经不利于菌体生长代谢物的积累，导致菌体自溶，菌体生物量呈下降趋势.故菌株的最佳接种时间为36 h.

定时间隔取发酵液，置于10 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min，取上清液测定酶活，其结果如图6所示.由图6可知，初始培养48 h内，菌株产右旋糖苷酶酶活较低，表明培养初期菌株主要靠消耗营养物质来维持菌体的增殖，基本不代谢产酶.当发酵时间超过48 h后，右旋糖苷酶活大幅度提高，至96 h产酶达到峰值，酶活为10.24 U/mL.这表明当菌株增殖到一定程度时，菌株开始分泌右旋糖苷酶，酶活出现剧增.随发酵过程的继续进行，96 h后产酶量开始降低，其原因是此时菌株进入衰亡期及营养物质的消耗，导致菌体的产酶能力减弱.所以，菌株的生物量与产酶能力有较密切的关系，为保证发酵过程中充分利用菌体增殖提高产酶能力，产酶发酵周期不宜超过96 h.

2.4.2 不同碳源对产酶的影响 右旋糖苷酶属于诱导酶，不同碳源对发酵产酶均有影响（见图7）.分别以质量浓度为10 g/L的蔗糖，右旋糖苷T2000，右旋糖苷T70，α-乳糖，葡萄糖，可溶性淀粉作为碳源，于37 ℃下，200 r/min发酵134 h，测定酶活力，结果如图7a）所示.从图7a）可知，在6种碳源中，以右旋糖酐T2000发作为碳源时右旋糖苷酶活力最高，可达到

12.29 U/mL;其次为右旋糖酐T70，以蔗糖、乳糖和可溶性淀粉为碳源时的产酶能力相对较弱，在5 U/mL左右;以葡萄糖为底物时几乎不产右旋糖苷酶.因此选择右旋糖酐T2000为发酵培养基的基础碳源.

在确定最适碳源后，考察碳源质量浓度对右旋糖苷酶酶活的影响，结果如图7b）所示.由图7b）可知，随着右旋糖苷T2000添加量的增加，右旋糖苷酶活呈先上升后逐渐下降的趋势，当右旋糖苷T2000质量浓度为20 g/L时，酶活达到14.6 U/mL，当其质量浓度超过20 g/L后，右旋糖苷酶活力逐渐降低.故20 g/L为右旋糖酐T2000最适质量浓度.

2.4.3 不同氮源对产酶的影响

不同氮源种类和质量浓度对发酵产酶有重要影响（见图8）.

在产酶基础培养基中，以质量浓度为20 g/L的右旋糖酐T2000为培养基的碳源，分别添加质量浓度为20 g/L 的牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硝酸钠、尿素、氯化铵、硫酸铵进行产酶发酵，试验结果如图 8a）所示.由图8a）可知，菌株SGC-2在以牛肉膏、蛋白胨等有机氮源作为氮源时右旋糖苷酶活力较高，其中以牛肉膏为氮源时酶活最高，达到19.86 U/mL.无机氮源的产酶能力相对低，其原因可能为蛋白胨和牛肉膏成分复杂，营养丰富，不仅可以作为氮源，还可以提供生长因子，促进微生物生长，从而提高产酶能力.因此，选择牛肉膏作为最佳氮源.

以牛肉膏为氮源，考察氮源质量浓度5 g/L，10 g/L，15 g/L，20 g/L，25 g/L和30 g/L对右旋糖苷酶酶活的影响，其结果如图8b）所示.随牛肉膏质量浓度的不断增加，右旋糖苷酶活力呈先提高后下降的趋势，当其质量浓度为10 g/L时，右旋糖苷酶活最高，达到22.45 U/mL.因此，确定牛肉膏的最适质量浓度為10 g/L.

2.4.4 NaCl 质量浓度对产酶的影响 为了研究氯化钠浓度对菌株产酶的影响，在发酵培养基中添加氯化钠至不同质量浓度，结果如图9所示.菌株的最适产酶NaCl质量浓度为4 g/L，当NaCl 质量浓度高于15 g/L后，菌株的产酶能力明显下降.当NaCl质量浓度达到25 g/L时，右旋糖苷酶产量不足最大产酶量的50%.由此可见，菌株产酶对NaCl质量浓度较为敏感.

2.4.5 接种量对产酶的影响 不同接种量对右旋糖苷酶酶活的影响如图10所示.由图10可知，接种量过低会造成发酵培养基营养过剩，微生物生长量不能产生足量的右旋糖苷酶，导致酶活偏低;接种量过高，菌体繁殖太多，发酵培养基营养不足以维持产酶，会导致酶活下降，故考察接种量对右旋糖苷酶酶活力的影响.在装液50 mL的发酵瓶中，当接种量由1%升至3%时，菌株产右旋糖苷酶酶活明显提高;当接种量为3%时，达最高酶活，为23.32 U/mL;当接种量超过3%时，酶活逐渐下降.故选择3%为最佳接种量.

2.4.6 装液量对产酶的影响 发酵液中溶氧量和氧气的传递效率与摇瓶装液量直接相关，会影响发酵液中菌体对营养物质的利用速率，从而影响右旋糖苷酶的生产效率.巨大芽孢杆菌为需氧微生物，所以装液量的大小直接影响着它的生长和右旋糖苷酶的产生.不同装液量对右旋糖苷酶酶活的影响如图11所示.由图11可知，在250 mL锥形瓶中加入30～80 mL 的液体发酵培养基，菌株产右旋糖苷酶的酶活随着装液量的增加先提高后降低：当装液量达到50 mL时，酶活达到最高，为24.48 U/mL;之后随装液量的逐步提高，产酶活逐渐降低.装瓶量过少，水分容易挥发，不能给菌株提供正常生产的足量营养，导致酶活偏低.而装液量过高时，氧气不足会影响菌株正常的新陈代谢.因此，确定右旋糖苷酶发酵培养基的最适装液量为50 mL.

2.4.7 综合试验优化结果 在上述优化的培养基及培养条件下，分别发酵培养菌株84 h，96 h，108 h，进一步确定产酶条件优化的可靠性.其结果如表3所示，在84 h，96 h，108 h这3个时间点，右旋糖苷酶酶活先升高后降低，其变化趋势同菌株的生长、发酵曲线一致.当发酵时间达96 h时，酶活达到最高，为28.32 U/mL，比优化前的11.26 U/mL提高了151%.

3 结论

本文用透明圈法从甘蔗土壤中筛选出了一株新的产高活性右旋糖苷酶菌株，经鉴定为巨大芽孢杆菌，对该菌株的产酶条件进行优化，得到该菌株产右旋糖苷酶发酵最优产酶条件为：右旋糖酐T2000质量浓度20 g/L，牛肉膏质量浓度10 g/L，NaCl质量浓度4 g/L，MgSO4质量浓度0.4 g/L，接种时间36 h，接种量3%，发酵时间96 h.该条件下酶活达到28.32 U/mL，与优化前的酶活11.26 U/mL 相比，提高了151%.该右旋糖酐酶产生菌目前未见相关报道，而且其产酶量较高，比其他产右旋糖酐酶产生细菌具有更大优势.本研究发现了新来源的右旋糖酐酶产生菌，为筛选高产右旋糖苷酶微生物的研究提供了一定的理论基础.

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