HPLC同时测定心可宁胶囊中羟基红花黄色素A和丹酚酸B的含量

李怀伟，张 朋，马昌豪

（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000）

心可宁胶囊为活血散瘀、开窍止痛的中成药。主要用于治疗冠心病，心绞痛，胸闷，心悸，眩晕[1-2]。心可宁胶囊处方由丹参、三七、冰片、水牛角浓缩粉、蟾酥、红花、牛黄、人参须组成[3]。其中，丹参是心可宁胶囊中的君药，具有改善心肌缺血，抑制血栓形成，活血化瘀等药理作用[4]，红花对心脑血管、神经系统、免疫系统等均具有一定作用[5-6]；两者均为心可宁胶囊的重要组成部分。红花和丹参的主要活性成分分别为羟基红花黄色素A和丹酚酸B，目前关于心可宁胶囊中羟基红花黄色素A或丹酚酸B单一成分含量测定的文献报道较多[7-8]，但同时测定两种成分含量的方法未见报道。本研究建立了高效液相色谱法（HPLC）同时测定心可宁胶囊中羟基红花黄色素A和丹酚酸B的含量，可用于该药品的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；XS105 DualRange型十万分之一天平（Mettler Toledo）；FRQ-1006HT型超声波清洗器（杭州法兰特）。

1.2 药品与试剂

甲醇（色谱纯，艾普利公司）；磷酸（色谱纯，科密欧公司）；超纯水；羟基红花黄色素A（中国食品药品检定研究院，批号：111637-201609）；丹酚酸B（中国食品药品检定研究院，批号：111562-201514）；心可宁胶囊（市售，批号：20160301，20160401，20160402）；红花阴性样品（自制，批号20170801）；丹参阴性样品（自制，批号20170802）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A和丹酚酸B各适量，加50%甲醇制成含羟基红花黄色素A0.0592 mg/ml，丹酚酸B0.4195 mg/ml的混合对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，取约0.5 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性溶液的制备 按工艺方法分别制备不含红花、丹参的阴性样品，按2.1.2项方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为甲醇-0.5%磷酸（35:65）；流速1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样体积10 µl；检测波长为286 nm（丹酚酸B）、403 nm（羟基红花黄色素A）。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性与系统适用性实验 取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液，依2.2项下色谱条件进样分析，考察方法系统适用性，结果见图1。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，而阴性样品溶液在此保留时间无相应的色谱峰出现，表明没有其他成分干扰。供试品色谱峰中羟基红花黄色素A和丹酚酸B与相邻色谱峰分离度均＞1.5，理论塔板数均不低于5000，方法适用性良好。

图1 混合对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液的HPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 取混合对照品溶液，按2.2项色谱条件，分别精密吸取2，4，8，10，12，15 µl，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，以对照品的进样量X（µg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，结果线性关系均良好。羟基红花黄色素A 回归方程为Y=3281.8X+5.9204，r=0.9994，线性范围为0.1184～0.8880 µg；丹酚酸B回归方程为Y=740.03X+22.439，r=0.9998，线性范围为0.8390～6.2925 µg。

2.3.3 精密度实验 取上述混合对照品溶液，按2.2项色谱条件，精密吸取10 µl，连续进样6次，记录色谱图。羟基红花黄色素A和丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.28%和0.53%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性实验 取同一批供试品（20160402）6份，按2.1.2项方法处理，按2.2项色谱条件测定，记录色谱图并计算含量，羟基红花黄色素A和丹酚酸B的RSD分别为0.78%和0.69%，表明方法有较好的重复性。

2.3.5 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h时，按2.2项色谱条件进样测定，测得供试品中羟基红花黄色素A和丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.28%和0.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 回收率实验 取已知含量的供试品（羟基红花黄色素A含量0.3548 mg/g，丹酚酸B1.2980 mg/g）6份，每份约2 g，分别加入新配制的对照品溶液（羟基红花黄色素A 0.3499 mg/mL丹酚酸B 1.3507 mg/ml）2 ml，按2.1.2项方法处理，按2.2项色谱条件进样测定，记录色谱图，计算两种组分的回收率，结果见表1。

表1 加样回收率实验结果（n=6）

2.4 含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按2.1.2项方法处理，按2.2项色谱条件测定，记录色谱峰峰面积，计算羟基红花黄色素色素A和丹酚酸B的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

根据羟基红花黄色素A和丹酚酸B的性质，考察了加热回流和超声提取两种方法的提取效果，并对不同溶剂和提取时间进行了综合考察，结果显示，50%甲醇对两种成分的提取效果最好，最终选用50%甲醇作为提取溶剂，同时发现超声提取与加热回流提取结果无显著差异，最终选用简单省时的超声提取方法。在流动相选择中，参照《中国药典》2015年版一部[9]考察了甲醇-乙腈-磷酸、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等多种比例的流动相，发现以甲醇-0.5%磷酸（35:65）为流动相，供试品和对照品溶液的色谱峰分离效果最好。

同时测定本品中两味或多味药材成分含量的文献鲜有报道，本研究采用DAD检测器双波长检测法，同时测定羟基红花黄色素A和丹酚酸B的含量，该方法专属性、稳定性较好，准确度高且方便快捷，可为心可宁胶囊的质量控制提供参考依据。