高效凝胶色谱法测定注射用美罗培南聚合物含量

2019-04-12于会贤黄世青

食品与药品 2019年2期

于会贤，黄世青，石凯

（1.沈阳药科大学，辽宁沈阳 110015；2.深圳华药南方制药有限公司，广东深圳 518106）

美罗培南是广谱碳青霉烯类抗生素，它是第一个可单独给药的4β-甲基碳青霉烯类抗生素，为临床常用的抗菌药物之一。抗生素分子本身作为半抗原通常不能直接引发过敏反应，但药物中存在的高分子杂质是引发各种速发性过敏反应的过敏原[1]。β-内酰胺类抗生素高分子杂质一般分为外源性和内源性两种，其中外源性杂质一般由发酵工艺中的蛋白质、多肽、多糖等杂质与抗生素结合而产生，而内源性杂质则为抗生素药物自身聚合的高分子杂质，即为抗生素聚合物。聚合物既可来自生产过程，又可在贮藏过程中形成，甚至在用药时也可产生。随着生产工艺的不断提高，产品中外源性杂质日趋减少，内源性聚合物的控制则应为当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。

中华人民共和国药典自2000年版起，已对多个β-内酰胺抗生素中的聚合物进行控制，所采用的方法均为葡聚糖凝胶Sephadex G-10凝胶色谱系统。然而Sephadex G-10凝胶色谱柱柱效低，分离效果差，因此目前国内逐渐开始采用高效凝胶色谱柱测定聚合物，常用Superdex Piptide色谱柱及TSK系列色谱柱进行测定[2]。本文采用Sephadex G-10与TSK GEL G2000SW/600凝胶色谱柱检测美罗培南聚合物并进行对比分析，建立了采用TSK GEL G2000SW/600凝胶色谱柱检查美罗培南聚合物的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（岛津LC-10AT型泵、SPD-20A型紫外检测器、LC Solution液相色谱数据工作站，日本岛津公司）；Sephadex G-10色谱柱（300 mm×13 mm）和TSK GEL G2000SW/600凝胶色谱柱（600 mm×7 mm）；Starious BT125D型电子天平（赛多利斯）；PHSJ-3F精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；CR-10LT型超纯水仪（上海杲森）。

1.2 药品与试剂

美罗培南对照品（中国药品生物制品检定所，批号130506-200702，含量87.0%）；注射用美罗培南（深圳华药南方制药）；原研参比样品[商品名：美平，规格：0.5 g，批号：2015C，住友制药（苏州）有限公司]，其余试剂为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备取美罗培南对照品约114 mg（含美罗培南无水物约100 mg）及无水碳酸钠约10 mg，精密称定，置入100 ml量瓶，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为美罗培南对照品溶液。需临用前配制。

2.1.2 注射用美罗培南供试品溶液制备取注射用美罗培南约13 mg（含美罗培南约10 mg），精密称定，置入10 ml量瓶，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为注射用美罗培南供试品溶液。需临用前配制。

2.1.3 空白辅料溶液制备取处方量的空白辅料适量，精密称定，置入10 ml量瓶，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为空白基质溶液。

2.1.4 系统适用性溶液制备将美罗培南对照品溶液于室温下放置1 h，作为系统适用性溶液。

2.2 色谱条件与测定法

以磷酸盐缓冲液（pH 7.0）[0.01 mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（61:39）]为流动相，柱温为30 ℃，流速为0.5 ml/min，检测波长为254 nm。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算美罗培南聚合物的总量。

2.3 方法学考察

图1 对照品溶液、供试品溶液及空白溶液的HPLC图谱

2.3.1 专属性试验精密量取美罗培南对照品溶液、注射用美罗培南供试品溶液、空白辅料溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

由图1可见，供试品溶液中主峰与对照品溶液中主峰出峰位置一致，且空白辅料在主峰及聚合物峰位置均无干扰。

2.3.2 线性关系试验精密称取美罗培南对照品5.75，11.50，23.89，35.68，46.04 mg，分别置入10 ml量瓶，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性关系试验溶液，样品溶液即配即用。精密量取各样品溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积结果见表1。

表1 美罗培南浓度与聚合物测定结果相关性试验

以美罗培南的浓度为横坐标（X），聚合物峰面积总和为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程为：Y=97 603X+19 169，R2=0.9995；再以美罗培南的浓度为横坐标（X），美罗培南峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程为：Y=16 556 344X+2 001 190，R2=0.9996。由试验结果可知，美罗培南浓度为0.5040～4.0359 mg/ml范围内，美罗培南浓度与美罗培南及其聚合物的峰面积线性关系良好。

2.3.3 重复性试验取注射用美罗培南及其对照品，照溶液配制方法制备注射用美罗培南供试品及对照品溶液，立即精密量取20 µl，注入液相色谱仪，同法配制6样品，进样测定，样品中聚合物的含量分别为0.491%，0.518%，0.504%，0.504%，0.514%，0.535%，平均值为0.511%，RSD为2.94%，说明本方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验取供试品溶液，分别于0，1，2 h进样，测得供试品溶液中高分子杂质含量分别为0.52%，3.71%，5.11%，试验结果显示，在室温条件下供试品溶液稳定性差，供试品溶液应临用前配制。

2.4 样品测定

取注射用美罗培南供试品及参比样品，照2.2项测定，记录色谱图，计算聚合物含量，各批样品检测结果见表2。

表2 注射用美罗培南聚合物检查结果

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

分别选用Sephadex G-10及TSK GEL G2000SW/600凝胶柱进行系统适用性试验，精密量取系统适用性溶液各20 µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。采用Sephadex G-10色谱柱时，理论板数按聚合物峰计为1054，理论板数按美罗培南峰计为21，聚合物峰与美罗培南分离度为0.6；采用TSK GEL G2000SW/600凝胶柱，理论板数按美罗培南聚合物峰计，最小为6057，理论板数按美罗培南峰计为18 953，聚合物色谱峰与美罗培南峰分离度为1.8。