硫化氢对镉胁迫下小麦幼苗的生长及生理指标的影响

张 蓓，郑 翔，黄 维，陈亚华，沈振国，陆 巍

(南京农业大学生命科学学院，江苏南京 210095)

随着现代工业的飞速发展和矿产资源的过度开发，各种污染物不断排放，土壤环境污染问题日益严重，其中重金属污染因其具有富集性、难降解、毒性强的特点而受到广泛关注。我国有接近0.2亿hm2的农田遭受着不同程度的重金属污染，每年因受重金属污染而减产的粮食约有1 000万t，合计损失达200亿元[1]。尚二萍等[2]研究表明，中国粮食主产区耕地土壤重金属污染点位超标率平均为21.49%，污染物以Cd、Ni、Cu、Zn 和Hg 为主，Cd污染比重最高，达到了17.39%，且耕地土壤重金属含量呈增加趋势。

Cd是植物生长的非必需元素，Cd2+被植物根部吸收并被运输至地上部分，在植物体内积累到一定水平后，会造成植物生理生化代谢紊乱，导致植物抗逆性降低，甚至造成植株死亡[3-6]。小麦(TriticumaestivumL.)是我国第二大粮食作物，其产量和质量直接关系国民经济的发展和人民的日常生活。孟自力等[7]研究指出，0.4～1.2 mmol·L-1的Cd2+对小麦种子萌发和幼苗生长有显著抑制作用；不同小麦品种、不同种植区域对镉胁迫的响应存在差异。因此，明确Cd2+胁迫对小麦幼苗生长的影响及外源物质缓解Cd2+毒害的机制对小麦安全生产具有重要作用。

硫化氢(H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的气体，已被确定为动物中继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后发现的第三种信号分子，参与哺乳动物的生理调节和疾病反应[8-10]，植物体内也能合成少量的H2S，调节植物的生长发育[11]。近年来，许多研究发现外源H2S能够提高植物对重金属胁迫的抵抗能力，如H2S通过增强ATPase活性、减少Al3+的吸收以及提高抗氧化能力来缓解Al对大麦的毒害作用[12]；H2S调控AsA-GSH循环，缓解豌豆所受的As毒害[13]；H2S通过调节半胱氨酸(Cys)代谢相关基因的表达，参与Cr6+诱导拟南芥中Cys含量增加的过程，并且H2S和Cys共同缓解Cr6+对拟南芥根长的抑制，同时上调PCS1和PCS2表达，增加金属硫蛋白和植物螯合肽的含量，提高拟南芥对Cr6+的耐受性[14]。Mostofa等[15]研究显示，250和500 μmol·L-1的CdCl2处理严重抑制水稻幼苗的生长，而添加100 μmol·L-1的NaHS能够提高抗氧化酶活性，减轻氧化伤害，维持离子平衡，缓解Cd2+对水稻幼苗生长的抑制。此外，H2S预处理可减少胡杨胞质中的Cd，增加Cd在胡杨液泡中的比例，缓解Cd诱导的细胞程序性死亡[16]。

目前，H2S对Cd2+胁迫下的小麦幼苗的生理生化影响和作用机理尚不清楚，尤其是在光合特性方面了解较少。本试验利用硫氢化钠(NaHS)作为H2S的外源供体，水培小麦幼苗至一叶一心期，添加不同浓度的NaHS预处理5 d，再用50 μmol·L-1CdCl2继续处理5 d，然后收苗测定各项生理生化指标，研究外源H2S对Cd2+胁迫下的小麦幼苗生长、光合、叶绿素荧光、Cd含量和抗氧化特性的影响，揭示H2S提高小麦幼苗耐Cd特性的作用机制，为小麦Cd污染的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为江苏省淮南麦区广泛种植的小麦品种苏科麦一号。硫氢化钠(NaHS)为H2S的供体，DL-炔丙基甘氨酸(PAG)为催化H2S合成的L-半胱氨酸脱巯基酶的抑制剂，均购于SIGMA(Sigma-Aldrich,Shanghai)，常规化学试剂(分析纯)购于国内化学试剂厂家(索莱宝科技有限公司、国药集团化学试剂有限公司、上海源叶生物科技有限公司等)。

1.2 试验方法

1.2.1 最佳NaHS浓度选择

挑选饱满一致的小麦种子用2.5%(v/v)次氯酸钠(NaClO)溶液消毒30 min，冲洗干净，在28 ℃的培养箱中遮光催芽。发芽后，换用1/2 Hoagland营养液，昼夜温度为26/18 ℃，光暗周期为16/8 h，光照强度为300 μmol·m-2·s-1，每隔1 d更换一次营养液。待小麦幼苗长至一叶一心期，挑选长势一致的小麦幼苗移至塑料杯中培养，随机分为6组，其中4组用含不同浓度NaHS(10、50、100和200 μmol·L-1)的Hoagland营养液预处理5 d，然后用含50 μmol·L-1的CdCl2的Hoagland营养液继续处理5 d；以Hoagland营养液处理5 d后，用含50 μmol·L-1CdCl2的Hoagland营养液处理5 d为Cd对照组；剩余组以Hoagland营养液处理10 d，为空白对照组。每个处理设置3个重复，处理结束后取测定部分生长、生理生化指标和Cd含量。

1.2.2 最佳外源NaHS对小麦活性氧(ROS)和非蛋白巯基(NPTs)含量的影响

由1.2.1确定最佳NaHS浓度后进行以下4组不同的处理：(1)Hoagland处理10 d的空白对照组(Control)；(2)NaHS处理5 d+Hoagland处理5 d(NaHS)；(3)Hoagland处理5 d+CdCl2处理5 d(Cd)；(4)NaHS处理5 d+CdCl2处理5 d(NaHS+Cd)，处理结束后取倒二叶进行活性氧(ROS)和非蛋白巯基(NPTs)含量测定。处理时期和方法同1.2.1。

1.2.3 NaHS影响小麦生长的机理研究

为探究NaHS对小麦生长的影响机理，用1.2.1中筛选的最佳NaHS浓度进行8组处理：(1)Hoagland处理10 d为空白对照(Control)；(2)NaHS处理5 d+Hoagland处理5 d(NaHS)；(3)PAG处理5 d+Hoagland处理5 d(PAG)；(4)NaHS+PAG处理5 d+Hoagland处理5 d(NaHS+PAG)；(5)Hoagland处理5 d+CdCl2处理5 d(Cd)；(6)NaHS处理5 d+CdCl2处理5 d(NaHS+Cd)；(7)PAG处理5 d+CdCl2处理5 d(PAG+Cd)；(8)NaHS+PAG处理5 d+CdCl2处理5 d(NaHS+PAG+Cd)。PAG的浓度设为1 mmol·L-1，培养方法同1.2.1；处理结束后测定各项指标。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 幼苗生长指标与Cd含量的测定

各处理随机挑选15株小麦幼苗，测量幼苗地上部和地下部的长度以及鲜重(FW)。将材料分为新叶、老叶、茎、根，置于105 ℃烘箱中杀青30 min，80 ℃下烘干至恒重(DW)；Cd含量的测定参照Zhao[17]的方法，用V(HNO3)∶V(HClO4)=87∶13的混合酸消煮样品，用2.5%稀HNO3定容，用电感耦合等离子体发射光谱仪ICP(Perkin Elmer Optima 2100DV,USA)测定Cd含量。Cd的转运系数定义为地上部Cd浓度与根部Cd浓度比值。

1.3.2 幼苗生理生化指标的测定

1.4 数据分析

使用SPSS 18.0对数据进行ANOVA分析，采用Duncan test进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaHS预处理对Cd2+胁迫下小麦幼苗生长的影响

与对照相比，不同浓度的NaHS预处理5 d对小麦幼苗的生长无明显影响(表中未列出)；而Cd2+胁迫幼苗的生长受到显著抑制(表1)，其中幼苗株高降低20.3%，根长降低22.3%，整株鲜重降低25.4%，整株干重降低24.6%。50和100 μmol·L-1的NaHS预处理能够显著缓解Cd2+胁迫小麦幼苗地上部生长的抑制，与Cd2+对照相比，株高分别增加6.7%和5.1%，鲜重分别增加21.9%和17.8%，干重分别增加19.8%和13.6%，而不同浓度的NaHS预处理下根长差异不显著。说明一定浓度的外源H2S预处理能够有效缓解Cd2+对小麦幼苗生长造成的抑制作用，对地上部分的作用效果更明显。

2.2 不同浓度NaHS预处理对Cd2+胁迫下小麦幼苗叶片光合色素和净光合速率的影响

10、50、100 μmol·L-1NaHS预处理5 d时小麦幼苗叶片中的总叶绿素含量、类胡萝卜素含量以及净光合速率(Pn)与空白对照无显著差异，200 μmol·L-1NaHS预处理5 d时小麦叶片的总叶绿素含量和Pn较空白对照显著降低(P<0.05，表中未列出)。如表1所示，与空白对照比较，Cd2+胁迫下幼苗的叶绿素含量、类胡萝卜素含量和Pn均显著降低，分别下降了28.4%、20.7%和21.7%。与单独Cd2+处理比较，光合色素含量和Pn随着NaHS预处理浓度的增加呈现先增后降特点，50 μmol·L-1NaHS预处理下叶绿素含量、类胡萝卜素含量和Pn显著提高，分别提高了12.6%、15.2%和10.8%。说明一定浓度的外源H2S预处理能够有效缓解Cd2+对小麦幼苗叶片光合色素合成的抑制和光合速率的降低，以50 μmol·L-1的NaHS预处理效果最好。

表1 不同浓度的NaHS对Cd2+胁迫下小麦幼苗的生长指标、叶片中光合色素含量和净光合速率的影响Table 1 Effects of different concentration of NaHS on the growth indexes, photosynthetic pigment contents and net photosynthetic rate of wheat seedlings under Cd2+ stress

Control：空白对照组；Cd：Cd对照组；S1+Cd～S4+Cd：不同浓度的NaHS溶液(10、50、100和200 μmol·L-1)预处理再加50 μmol·L-1的CdCl2溶液处理组。同列数据后不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Control is the group with no treatment; Cd is the group treated with 50 μmol·L-1cadmium chloride solution; S1+Cd～S4+Cd are the groups pretreated with different concentrations of NaHS solution (10, 50, 100, 200 μmol·L-1) and then treated with 50 μmol·L-1cadmium chloride solution. Different letters following the values in the same column indicate significant differences among the treatments at 0.05 level. The same below.

2.3 不同浓度NaHS对Cd2+胁迫下小麦体内Cd含量和分布的影响

由表2可知，Cd对照小麦幼苗根部和地上部分的Cd积累量分别为2 596.73 μg·g-1DW和546.99 μg·g-1DW。与Cd2+对照相比，NaHS预处理显著降低了老叶和地上部的Cd含量，以50 μmol·L-1的NaHS预处理降低幅度最大(21.6%、9.8%)，而茎秆、新叶中的Cd含量与Cd2+对照并无显著差异；50和100 μmol·L-1的NaHS预处理显著增加了小麦根系中的Cd含量，分别提高了24.5%和23.7%。NaHS预处理使小麦中Cd转运系数显著下降，以50 μmol·L-1NaHS预处理的效果最好，降低了27.5%，因此利用这一浓度进行下面的研究。

2.4 H2S对Cd2+胁迫下小麦幼苗叶片中MDA、H2O2和积累的影响

表2 H2S对Cd2+胁迫下小麦茎秆、新叶、老叶、地上部分、根系中Cd含量以及转运系数的影响Table 2 Effects of H2S on Cd concentration in the wheat stem, the new leaf, old leaves, shoot, root and Cd translocation factors under Cd2+ stress

表3 H2S对Cd2+胁迫下小麦叶片中的含量和小麦根中NPTs含量的影响Table 3 Effects of H2S on MDA, H2O2, contents of wheat leaves and NPTs contents both of wheat leaves and roots under Cd2+ stress

图1 H2S对Cd2+胁迫下小麦叶片的DAB和NBT的染色结果

表4 不同处理对Cd2+胁迫下小麦幼苗生长的影响Table 4 Effects of different treatments on the growth of wheat seedlings under Cd2+ stress

2.5 H2S对Cd2+胁迫下小麦NPTs含量的影响

较空白对照，单独NaHS预处理显著增加了小麦叶片和根的NPTs含量，分别增加了23.9%和98.6%；Cd2+胁迫显著增加了根部的NPTs含量；NaHS+Cd与单独Cd2+处理相比，叶片和根的NPTs分别增加了12.5%和49.5%(表3)。

2.6 H2S抑制剂对Cd2+胁迫下小麦幼苗生长的影响

如表4所示，1 mmol·L-1的PAG处理对小麦幼苗被测生长指标均有显著抑制作用。50 μmol·L-1的NaHS预处理后，株高和地上部干重显著增加。在Cd2+存在下，NaHS+PAG预处理与PAG预处理相比，株高和地上部干重分别显著提高了6.7%和29.2%；NaHS对小麦根长和地下部干重影响不显著。说明外源NaHS预处理对Cd2+胁迫小麦的地上部生长有明显正效应。

2.7 H2S抑制剂对Cd2+胁迫下小麦幼苗光合特性的影响

Cd2+胁迫显著降低了小麦叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)，NaHS+Cd处理使Pn、Tr和Gs分别提高了16.3%、25.3%和29.6%，差异均显著(表5)； PAG预处理使小麦幼苗上述指标显著下降，而NaHS+PAG预处理使Pn和Ci显著增加；在Cd2+胁迫下，NaHS+PAG预处理与PAG

预处理相比，Pn、Gs和Ci分别提高了18.5%、38.9%和24.9%，差异显著。说明外源H2S对Cd2+胁迫下小麦幼苗的光合作用具有明显上调作用。

2.8 H2S抑制剂对Cd2+胁迫下小麦幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

如表6所示，Cd2+胁迫使荧光参数值显著降低，ABS/CSm、TRo/CSm、DIo/CSm和ETo/CSm分别降低了10.6%、10.7%、10.0%和14.8%；除了PAG处理组，各处理下的最大光化学效率Fv/Fm与对照相比无显著差异；Cd2+处理使光系统Ⅱ(PS Ⅱ)的性能指数PIABS显著降低了18.3%；NaHS+Cd与Cd处理相比，ABS/CSm、TRo/CSm、DIo/CSm、ETo/CSm和PIABS分别提高了9.2%、9.0%、10.0%、13.0%和16.4%，差异显著。在Cd2+胁迫下，NaHS+PAG与PAG处理相比，ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm和PIABS分别提高了7.4%、8.7%、17.6%和30.8%，差异显著。表明H2S处理显著改善了Cd胁迫下小麦叶片PS Ⅱ的光合性能指数与光能转化效率。

表5 不同处理对Cd2+胁迫下小麦幼苗光合特性的影响Table 5 Effects of different treatments on photosynthetic characteristics of wheat seedlings under Cd2+ stress

表6 不同处理对Cd2+胁迫下小麦幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响Table 6 Effect of different treatments on chlorophyll fluorescence parameters of wheat leaves under Cd2+ stress

3 讨 论

Cd是植物生长发育非必需营养元素之一，浓度过高对植物有很强的毒害作用，严重影响植物的生长发育和代谢[24-26]。在本研究中，Cd2+胁迫显著抑制了小麦幼苗生长。外源低浓度的NaHS预处理能够增加小麦幼苗的株高和生物量，说明外源低浓度的NaHS预处理可以提高小麦幼苗对Cd2+胁迫的耐受能力。Tian等[27]研究发现，镉胁迫抑制谷子叶片光合色素合成并加速光合色素降解，降低植物叶片的光合速率。在本研究中，Cd2+处理显著降低小麦幼苗叶片中光合色素含量，而NaHS预处理后的光合色素含量与单独Cd2+处理相比显著增加，与前人的报道一致[28-29]；不同浓度的NaHS对小麦的净光合速率影响与生物量、光合色素含量的变化有相似的趋势。本研究中，Cd2+胁迫使小麦幼苗叶片中Pn、Gs和Ci显著降低，小麦幼苗叶片Pn的降低多数由气孔限制因素引起[30-31]；而外源施加H2S能够显著提高Pn、Gs和Tr，说明H2S能够维持小麦叶片较高的光合能力，这可能与NaHS预处理下小麦幼苗叶片中光合色素含量显著增加有关。

Liu等[32]报道，Cd胁迫对棉花叶片的最大光化学效率、量子产额、电子传递速率以及光化学淬灭的抑制与光合作用的减弱密切相关。本研究结果显示，Cd2+显著降低了小麦叶片的ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm以及DIo/CSm，而NaHS预处理显著提高了以上参数值，说明H2S提高了Cd2+胁迫下小麦幼苗叶片单位激发态面积吸收的能量、捕获的用于还原QA的能量、还原态QA通过电子传递再氧化的活性以及以热的形式耗散多余的能量，从而加快电子传递速率、保护光合机构。

在正常情况下，Fv/Fm保持在0.8左右，而逆境胁迫会对PS Ⅱ造成损伤或者发生光抑制，导致植物叶片Fv/Fm显著下降[33]，但Fv/Fm对Cd2+胁迫不敏感[34]。而PIABS表示PS Ⅱ以吸收光能为基础的光合性能指标，反映原初光化学反应的最大量子产额以及电子传递的量子产额，相比Fv/Fm对逆境更敏感[35-36]。本研究发现，Cd2+胁迫处理能显著降低小麦幼苗叶片的PIABS，而外源H2S显著提高PIABS，说明H2S提高了PS Ⅱ反应中心的氧化还原活性。

NaHS预处理显著增加小麦根部对Cd的吸收积累，而地上部分Cd含量降低，推测H2S的作用是将大量的Cd固定在根中，减少向地上的转运，从而显著降低转运效率。类似的结果还出现在Hg2+胁迫处理的水稻幼苗中，Chen等[38]发现NaHS预处理增加水稻幼苗根中Hg含量，而显著降低地上部分的Hg含量。并且本研究首次发现NaHS预处理使小麦老叶中Cd含量显著降低、使新叶中Cd含量变化不显著。原因可能与NaHS和Cd2+处理时间有关，也可能是H2S会导致Cd在地上各部位的分配和积累产生差异。

植物抵抗重金属毒害的机制有多种，其中一种便是胞内含硫化合物与重金属形成毒性较低的络合物，包括非蛋白巯基化合物(NPTs)和蛋白巯基化合物，其中NPTs又包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PCs)[39]。H2S在植物体内能够快速氧化成过硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、硫酸盐等，从而保持较低的H2S浓度，而那些氧化产物通过各种催化途径合成GSH[40]，GSH是NPTs的主要组成部分，含有一个活泼的巯基基团，易被氧化，对于清除ROS、与Cd2+形成络合物、促进PCs合成等具有重要作用[41]。本研究发现，H2S可促进根部NPTs的合成来固定根中的Cd2+，减少其向地上部分的转运。

综上所述，外源H2S通过增加小麦叶片和根中NPTs的含量，络合过量的Cd2+，减少叶片中的ROS积累，增加叶绿素含量，保护光合电子传递系统，维持较高的光合能力，促进小麦幼苗生长，提高小麦幼苗对Cd2+胁迫的耐性。