葡萄VQ motif-containing蛋白家族基因鉴定及其在胁迫响应中的作用研究

王鹏飞，代玲敏，王珊，李廷刚，任凤山*，王咏梅*

（1. 山东省葡萄研究院/山东省葡萄栽培与精深加工工程研究中心，山东济南 250100；2. 滨州医学院药学院，山东烟台 264000；3. 农业部华东都市农业重点实验室，山东济南 250100）

在植物中，WRKY蛋白家族是一个大的转录因子家族[1-4]，在大多数物种中都能被发现，例如玉米、水稻、拟南芥等[5-6]。WRKY蛋白家族成员参与许多生物胁迫与非生物胁迫的响应[7-8]，参与叶片的衰老过程[9-10]、激素信号转导[11-12]以及种子发育[13]。目前很多研究证实，VQ motif-containing蛋白可以与WRKY转录因子物理互作[14-15]，在植物生长发育及压力响应中发挥重要作用[16]。VQ motif-containing蛋白家族成员是一种植物特异蛋白，每个成员都含有一段高度保守的含有10个氨基酸短基序FxxhVQxhTG（h：疏水氨基酸；x：任何氨基酸）motif，这段短基序包含F、V、Q、T以及G五个保守氨基酸残基。VQ motif-containing蛋白是通过V和Q这两个保守的氨基酸残基与WRKY转录因子蛋白互作[17]。

第一个被发现的VQ motif-containing蛋白含有222个氨基酸残基，后来在其他双子叶和单子叶植物中也陆续发现了该蛋白的同源蛋白。这些蛋白都被发现含有这个保守的FxxhVQxhTG基序，因而这些蛋白家族成员最后被命名为VQ motif-containing蛋白[18]。第一个被发现的拟南芥VQ motif-containing蛋白MKS被证实可以与拟南芥AtWRKY25和AtWRKY33蛋白互作形成复合体。而这个复合体涉及植物防御反应的调控[18]。在正常生长条件下，拟南芥MPK4蛋白通过与WRKY33和MKS蛋白互作形成复合物定位在细胞核中。而在假单胞菌感染或鞭毛蛋白处理的条件下，MPK4会使MKS蛋白磷酸化，从而释放WRKY33蛋白，参与生物胁迫的抵御[18-19]。而拟南芥AtVQ29可以与一种bHLH转录因子家族成员PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR1（PIF1）互作，从而作为光介导抑制下胚轴伸长的负转录调节因子[20]。

很多物种中的VQ motif-containing蛋白被证实参与生物胁迫的抵御。例如拟南芥的AtVQ23（SIB1）和AtVQ16（SIB2）蛋白通过与AtWRKY33互作参与植物生物胁迫防御[21]。水稻中多种VQ motif-containing蛋白在稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和稻瘟病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）感染后表达发生显著变化[22]。拟南芥中VQ motif-containing蛋白AtVQ12和AtVQ29蛋白在植株防御灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的感染中发挥负调控作用[23]。很多VQ motifcontaining蛋白被证实也参与植物非生物胁迫响应。例如拟南芥VQ9蛋白可作为AtWRKY8转录因子的抑制因子，维持AtWRKY8介导的盐胁迫耐受通路[24]。拟南芥中AtVQ15蛋白可以负调控植株对盐与渗透压力的耐受[25]。此外，很多VQ motif-containing蛋白被证实可以调控植物发育过程，例如拟南芥AtVQ14（IKU1）被证实在种子发育中发挥关键的作用[26]。

本研究将从全基因范围鉴定葡萄VQ motif-containing蛋白家族基因并分析其蛋白结构、在各种生物和非生物胁迫下的表达模式、进化中受到的选择压力。并利用生物信息学方法预测葡萄VQ motif-containing蛋白成员的亚细胞定位及其互作蛋白。

1 材料与方法

1.1 VQ motif-containing蛋白家族成员的鉴定

葡萄的蛋白序列从最新版本葡萄基因组数据库（V2.0）中获得（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）。用HMMER软件，基于VQ motif结构域（Pfam ID: PF05678）的隐马克夫模型（Hidden Markov Model，HMM），搜索葡萄中全部的VQ motif-containing蛋白，从而鉴定葡萄VQ motifcontaining蛋白家族基因。利用在线软件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）来确定这些搜索到的蛋白是否具有完整的VQ motif结构域，如不含有完整的VQ motif结构域则被筛除。

1.2 VQ motif-containing 蛋白家族成员的亚细胞定位方法

利用ProtComp 9.0软件（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgrou p=proloc）预测VQ motif-containing蛋白家族成员的亚细胞定位；利用cNLS Mapper软件（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）分析这些成员的核定位信号；用TMHMM2.0软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析这些成员的跨膜结构域。

1.3 多重序列比对与进化树分析

利用ClustalX2.0软件进行蛋白多重序列比对分析；用PHYLIP软件构建系统发育树，方法为邻接法（Neighbor-Joining tree）[27]。

1.4 基因表达分析

芯片表达谱结果的MAS5-calculated signal intensity value作为标准化的基因表达量。非生物胁迫处理包括1 h、4 h、8 h、24 h的盐胁迫处理，1 h、4 h、8 h的冷胁迫处理，以及1 h、4 h、8 h、24 h的PEG模拟干旱处理。表达谱数据来源于NCBI的GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31594），数据登记号为GSE31594。脱落酸（ABA）处理时间包括3 d和10 d。表达谱数据来源于NCBI的GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31662），数据登记号为GSE31662。白粉病感染材料包括易感病的‘赤霞珠’葡萄（Cabernet sauvignon）以及抗白粉病能力较强的‘诺顿’（Norton）葡萄。表达谱数据来源于于NCBI的GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE6404），数据登记号为GSE6404。GLRaV-3兼容性病毒病感染下表达谱数据来源于Plant Expression Database数据库（http://www.plexdb.org/modules/PD_browse/experiment_browser.php）。不同样本中表达差异倍数大于1.5且t-testP＜0.05的基因被认为是差异基因。

1.5 蛋白互作分析

蛋白互作预测软件STRING（https://string-db.org/）分析VQ motif-containing蛋白家族成员之间及与葡萄中其他蛋白之间的互作。

1.6 选择压力分析

Codeml program under PAML (version 4.7 software)[28]分析葡萄VQ motif-containing蛋白基因在进化过程中受到的选择压力。使用软件中的3个位点模型分析：M0（one ratio）用于分析整体受到的选择压力，M7（beta）vs M8（beta and ω）模型被用于鉴定正向选择位点[29]。

2 结果与分析

2.1 葡萄VQ motif-containing蛋白基因的鉴定与进化树分析

本文共鉴定出18个葡萄VQ motif-containing蛋白家族成员（表1）。利用MEME软件对这些VQ motifcontaining蛋白家族成员的VQ motif进行分析。结果发现，葡萄VQ motif-containing蛋白家族最保守的VQ motif序列LOGO为“FRALVQELTG”。全部成员的VQ motif含有的VQ motif序列均为FxxhVQxhTG型短序列。其中蛋白序列最长的家族成员为VIT_218s0001g05400，含有4 6 4个氨基酸；蛋白序列最短的家族成员为VIT_214s0081g00190，含有110个氨基酸。

利用ProtComp 9.0软件预测了这些家族成员的亚细胞定位。除了VIT_213s0084g00670能定位在过氧化物酶体和叶绿体里，其他都定位在细胞外。利用TMHMM2.0软件对这些成员的跨膜结构域进行了分析。膜定位分析显示，这些成员都不能定位在膜上。而VIT_213s0084g00670可以在膜内，其他成员都定位在膜外，利用cNLS Mapper软件分析了这些成员的核定位信号，结果显示这些成员都不包含核定位信号。

表1 葡萄VQ motif-containing蛋白基因IDTable 1 VQ motif-containing protein gene ID of grape

图1 葡萄VQ motif-containing蛋白家族成员的系统发育树Figure 1 Phylogenetic trees of grape VQ motf-containing protein family members

基于这18个葡萄VQ motif-containing蛋白家族成员的蛋白序列构建了系统发育树。自举值（boostrap value）大于700的分枝中含有的成员被分为一个亚家族。这18个成员一共被分为6个亚家族。VIT_208s0040g00540和VIT_212s0028g00500没有被分在任何一个亚家族中，被认为孤儿基因（图1）。

2.2 葡萄VQ motif-containing蛋白基因在不同非生物胁迫、CBF转基因植株及ABA处理后的表达

利用表达谱数据分析了这些葡萄VQ motif-containing蛋白基因在不同非生物胁迫下的表达情况。结果显示，与对照相比，VIT_200s0304g00030基因在冷胁迫1 h和8 h后上调；VIT_200s0471g00020基因在盐胁迫或PEG胁迫4 h后下调，而在盐胁迫或PEG胁迫24 h后上调；VIT_201s0011g01350基因在1 h、4 h、8 h冷胁迫后均上调；VIT_201s0011g03650和VIT_202s0012g01280基因在盐胁迫或PEG胁迫24 h后下调；VIT_204s0008g06930基因在冷胁迫1 h后上调；VIT_208s0007g05180在PEG胁迫24 h后上调；VIT_208s0040g00540基因在1 h、4 h、8 h冷胁迫后均上调；VIT_212s0028g00500基因在盐胁迫或PEG胁迫24 h后上调；VIT_218s0166g00090基因在盐胁迫24 h后下调；VIT_219s0014g02490基因冷胁迫4 h、8 h后下调；VIT_218s0001g05400基因在冷胁迫1 h、8 h后上调。

CBF4基因在葡萄抗逆途径中起到关键的调控作用。为了研究葡萄VQ motif-containing蛋白基因是否受到CBF4基因调控，利用表达谱数据分析了这些葡萄VQ motif-containing蛋白基因在过表达葡萄VvCBF4基因葡萄植株中的表达情况。转基因砧木品种为‘自由’，表达谱数据来源于NCBI的GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE29948），数据登记号为GSE29948。结果显示，与野生型的‘自由’相比，转基因葡萄植株中的VIT_200s0304g00030、VIT_201s0011g01350、VIT_204s0008g06930、VIT_208s0040g00540和VIT_218s0001g05400表现上调；VIT_200s0471g00020、VIT_202s0012g01280和VIT_219s0014g02490表现下调。

利用表达谱数据分析了这些葡萄VQ motif-containing蛋白基因在ABA处理中的表达情况。结果显示，相对于正常未处理的葡萄，VIT_200s0471g00020、VIT_201s0011g01350、VIT_208s0007g05180、VIT_212s0028g00500及VIT_213s0156g00160基因在ABA处理3 d和10 d的条件下均下调；而VIT_201s0011g03650和VIT_213s0084g00670基因在ABA处理3 d和10 d的条件下均上调；VIT_218s0166g00090基因在ABA处理3 d的条件下上调；VIT_208s0007g06470基因在ABA处理10 d的条件下均上调。

2.3 葡萄VQ motif-containing蛋白基因在不同生物胁迫中的表达

利用表达谱数据分析了这些葡萄V Q m o t i fcontaining蛋白基因在GLRaV-3兼容性病毒病感染下的表达情况。表达谱数据来源于Espinoza等[30]的结果。结果显示，与未感染病毒的对照植株相比，VIT_200s0304g00030、VIT_200s0471g00020、VIT_212s0028g00500、VIT_218s0166g00090、VIT_219s0014g02490及VIT_218s0001g05400基因均上调；VIT_201s0011g01350、VIT_201s0011g03650、VIT_208s0040g00540及VIT_213s0156g00160基因均相对于对照植株表达下调。

利用表达谱数据分析了这些葡萄VQ motif-containing蛋白基因在白粉病感染下葡萄植株中的表达情况。结果显示，相对于未感病的对照植株，在感病12 h时，VIT_200s0471g00020基因在‘赤霞珠’中表达下调，而VIT_200s0471g00020基因在‘诺顿’中表达也下调；VIT_201s0011g01350基因在感病12 h和48 h的‘赤霞珠’中表达上调，而在‘诺顿’中变化不显著；VIT_208s0007g05180基因在感病24 h和48 h后的‘赤霞珠’中上调，‘诺顿’也均显著上调；VIT_213s0156g00160基因在感病4 h的‘赤霞珠’中表达下调，在‘诺顿’葡萄中变化不显著。

2.4 葡萄VQ motif-containing蛋白互作分析

蛋白互作软件预测结果显示，V Q m o t i fcontaining蛋白家族成员VIT_200s0471g00020能与另外7个VQ motif-containing蛋白家族成员互作，包括VIT_204s0008g06930、VIT_218s0001g06350、VIT_201s0011g03650、VIT_218s0166g00090、VIT_209s0002g07540、VIT_208s0007g06470和VIT_218s0001g05400。其中的家族成员间也有互作，如VIT_208s0007g06470可以与VIT_218s0166g00090互作，VIT_209s0002g07540可以与VIT_201s0011g03650和VIT_218s0001g06350互作，VIT_201s0011g03650可以与VIT_204s0008g06930互作，VIT_218s0001g06350可以与VIT_204s0008g06930互作。预测结果还显示，VQ motif-containing蛋白家族成员VIT_213s0084g00670可以与WRKY家族蛋白VIT_208s0058g00690（WRKY33）、Sigma70_r2结构域包含蛋白VIT_215s0024g00640、VIT_216s0050g02520及VIT_216s0039g00660互作；VQ motif-containing蛋白家族成员VIT_208s0007g05180也可与和WRKY家族蛋白VIT_208s0058g00690（WRKY33）、Sigma70_r2结构域包含蛋白VIT_215s0024g00640、VIT_216s0050g02520及VIT_216s0039g00660互作。

2.5 葡萄VQ motif-containing蛋白家族基因受到的选择压力

利用PMAL软件分析了葡萄VQ motif-containing蛋白家族各个亚家族所受到的选择压力。M0模型结果显示，亚家族1（group 1）的omega（dN/dS）为0.60826，说明该亚家族整体在进化历史中受到纯化选择。M7 vs M8模型结果显示，有13个ayes Empirical Bayes（BEB）正向选择位点。M0模型结果显示，亚家族2（group 2）的omega（dN/dS）为0.58661，说明该亚家族整体在进化历史中受到纯化选择。M7 vs M8模型结果显示，有超过30个ayes Empirical Bayes（BEB）正向选择位点。M0模型结果显示，亚家族3（group3）的omega（dN/dS）为0.60826，说明该亚家族整体在进化历史中受到纯化选择。M7 vs M8模型结果显示，有13个ayes Empirical Bayes（BEB）正向选择位点。M0模型结果显示，亚家族3（group3）的omega （dN/dS）为0.28288，说明该亚家族整体在进化历史中受到纯化选择。M7 vs M8模型结果显示，有超过50个ayes Empirical Bayes（BEB）正向选择位点。M0模型结果显示，亚家族4（group 4）的omega（dN/dS）为0.21844，说明该亚家族整体在进化历史中受到纯化选择。M7 vs M8模型结果显示，有6个ayes Empirical Bayes（BEB）正向选择位点。M0模型结果显示，亚家族5（group 5）的omega（dN/dS）为0.51739，说明该亚家族整体在进化历史中受到纯化选择。M7 vs M8模型结果显示，有12个ayes Empirical Bayes（BEB）正向选择位点。M0模型结果显示，亚家族6（group 6）的omega（dN/dS）为0.23406，说明该亚家族整体在进化历史中受到纯化选择。M7 vs M8模型结果显示，有13个ayes Empirical Bayes（BEB）正向选择位点。

3 讨论与结论

本文鉴定出18个葡萄VQ motif-containing蛋白基因。前人已在水稻、玉米、茶树和竹子中鉴定VQ motifcontaining蛋白基因，分别为39个、61个、25个和25个[22,31-33]。葡萄中鉴定出较少的VQ motif-containing蛋白基因可能是因为葡萄只经历过一次古六倍化事件，而没有经历过其他基因组复制事件[34]。分析发现，葡萄中VQ motif-containing蛋白最保守的序列LOGO是“FRALVQELTG”。而之前的研究报道，茶树VQ motif-containing蛋白最保守的序列LOGO是“FKQVQMLTG”[32]。这说明不同物种中VQ motif的序列差别可能很大。对茶树VQ motif-containing蛋白的亚细胞定位研究结果显示，很多茶树VQ motif-containing蛋白可以定位在叶绿体和细胞核中。本结果显示，除了VIT_213s0084g00670能定位在过氧化物酶体和叶绿体里，其他葡萄VQ motif-containing蛋白都定位在细胞外。膜定位分析显示，这些成员都不能定位在膜上，且都不包含核定位信号。这说明葡萄VQ motif-containing蛋白不能定位在细胞核中。推测可能不同物种中的VQ motifcontaining蛋白的亚细胞定位存在较大的差异。系统发育树分析显示，竹子、茶树的VQ motif-containing蛋白家族可以被分为6个亚家族[32-33]，与在葡萄中的研究结果相一致，并且发现了2个孤儿VQ motif-containing蛋白基因。

之前的研究显示VQ motif-containing蛋白家族在生物及非生物胁迫起到重要作用[21-25]。本结果发现很多葡萄VQ motif-containing蛋白基因在干旱、盐或冷胁迫下表达发生变化，说明很多葡萄VQ motif-containing蛋白基因可以响应这些非生物胁迫，并可能在这些非生物胁迫耐受中发挥作用。葡萄CBF4基因在葡萄抗寒过程中起到重要的作用[35]。而本研究结果显示，一些葡萄VQ motif-containing蛋白基因在CBF4过表达的葡萄植株中表达发生变化。这说明葡萄CBF4基因可能调控这些葡萄VQ motif-containing蛋白基因的表达。ABA信号转导途径在干旱、盐和冷胁迫响应中起到重要的作用[36]。而本研究发现很多葡萄VQ motif-containing蛋白基因的表达可以受到外源ABA处理的影响，说明这些葡萄VQ motifcontaining蛋白基因可能直接响应ABA信号或者能受到ABA信号转导途径中基因的调控。

本结果显示很多葡萄VQ motif-containing蛋白基因的表达会受到病毒感染或白粉病感染的影响，说明这些葡萄VQ motif-containing蛋白基因可能在这些生物胁迫耐受中发挥作用，包括在病毒感染和致病菌胁迫耐受。通过比较易感病品种‘赤霞珠’和抗病品种‘诺顿’感染白粉病后VQ motif-containing蛋白基因的表达变化发现，二者中大部分相同VQ motif-containing蛋白基因的表达趋势一致。但是VIT_213s0156g00160和VIT_201s0011g01350的变化趋势在二者之间不同。因此推测这可能是二者抗病能力差异的原因之一。

之前的研究显示，VQ motif-containing蛋白家族成员可以通过与WRKY转录因子互作发挥作用[18,24]。第一个被发现的拟南芥VQ motif-containing蛋白MKS可以与拟南芥AtWRKY33和AtWRKY25蛋白互作[18]。茶树中部分VQ motif-containing蛋白也可以与茶树WRKY33和WRKY25蛋白互作[32]。本结果显示VIT_208s0007g05180和VIT_208s0058g00690也可以与葡萄WRKY33互作，但是未发现有与葡萄WRKY25互作的葡萄VQ motifcontaining蛋白。之前的研究显示，有的植物VQ motifcontaining蛋白可能与MPK4和PIF1互作[18,20]，而本研究结果显示，部分葡萄VQ motif-containing蛋白还可以与多个Sigma70_r2结构域包含蛋白互作。

此外，本研究发现葡萄VQ motif-containing蛋白家族在进化历史中主要遭受纯化选择，其中6个亚家族均遭受纯化选择。而大量正向选择位点的发现也说明尽管VQ motif-containing蛋白家族在进化历史中主要遭受纯化选择，但是正向选择也对葡萄VQ motif-containing蛋白家族的进化产生了一定影响。基因家族受到正向选择或含有正向选择位点，说明家族成员功能可能发生分歧或家族成员进化出新功能[37]。VQ motif-containing蛋白家族在生物及非生物胁迫起到重要作用[21-25]，因此推测这些功能在进化过程中可能受到选择压力的影响。