敲除Ras1基因对裂殖酵母生长及产孢影响

谭秀梅 丁 祥 袁荣美 侯怡铃

（1.西华师范大学生命科学学院西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009；2.西华师范大学环境科学与工程学院，四川 南充 637009）

Ras1基因有很多功能，能直接激活参与细胞极性调节细胞形状的建立或维持的SCD1。此外，科学家发现Ras1基因还能够参与Cdc42蛋白信号转导，能够提高蛋白质定位到细胞核的概率。

在裂殖酵母中，Ras1基因的缺失会降低交配率。但鲜少有人研究仅Ras1基因的缺失对裂殖酵母产孢及生长的影响，该实验采用基因敲除技术，敲除Ras1基因，探究Ras1基因的缺失对裂殖酵母的生长和产孢的影响，为科学的判定其敲除基因的功能和合理开发裂殖酵母资源提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

1.1.1 材料

供试菌株及野生型菌株（表1）现保存在西南野生动植物资源保护教育部重点实验室-80 ℃的冰箱中。

1.1.2 酵母生长所需培养基及药品试剂

裂殖酵母完全培养液YES、完全固体培养基、裂殖酵母产孢培养基 E mm-N参照王文超[5]的方法配制。药品试剂：PBS缓冲液、纤维素酶（购于阿拉丁公司）。

1.2 方法

1.2.1 生长曲线的测定

分别在25 ℃、37 ℃恒温摇床中培养，用酶标仪每隔2 h测一次培养液OD595值，连续测12 h，每个处理重复3次。以培养时间为横坐标、OD595值为纵坐标，绘制生长曲线图。

1.2.2 裂殖酵母产孢及孢子形态观察

将野生型 PT286与 PT287交配作为对照组，3201菌株的h+与 h-交配作为实验组，置于25 ℃恒温箱中培养24 h后制片，在显微镜下观察并统计20个产孢酵母的孢子数，截取典型孢子形态图。

2 结果与分析

2.1 裂殖酵母在25 ℃下生长分析

在25 ℃恒温培养下，生长曲线图如图1所示。从图1可以看出，在0～6 h，野生型 PT286生长要略快于3201菌株；在8 h， 两菌OD595值相同为0.34；8 h以后，PT286的生长持续加速且未见衰退趋势，而3201菌株的生长逐渐趋于平缓；在12 h，PT286的OD595值为0.62，大于3201的0.48。说明敲除基因 Ras1会使裂殖酵母的生长变慢。

图1 裂殖酵母在25 ℃下的生长曲线图

2.2 裂殖酵母在37 ℃下生长分析

在37 ℃恒温培养下，生长曲线图如图2所示。从图2可以看出，在0～6 h，野生型 PT286生长速度要快于3201菌株，但差距不大；6 h以后，PT286迅速生长明显快于3201菌株；在12 h，PT286的OD595值达到0.84，而3201的OD595值为0.45，与25 ℃的几乎一致，说明突变株对温度不敏感。在25 ℃及37 ℃恒温条件下，敲除基因Ras1都会使其生长变慢，其具体机制还有待进一步研究。

2.3 裂殖酵母孢子数分析

我们分别统计20个裂殖酵母所产生的孢子，结果如图3所示，野生型裂殖酵母100 %产生4个孢子；3201菌株有75 %裂殖酵母产生1个孢子，25 %裂殖酵母产生2个孢子 。说明敲除基因Ras1会影响裂殖酵母孢子量。

图2 裂殖酵母在37 ℃下的生长曲线图

图3 裂殖酵母孢子数

2.4 裂殖酵母酵母孢子形态图分析

孢子形态图如图4所示，结果表明，野生型裂殖酵母产生4个孢子，其形态如图4（a）所示，3201菌株产生1～2个孢子，其形态如图4（b）、图4（c）所示，在相同观察倍数下，野生型的孢子略大于3201菌株产生的孢子，说明敲除基因 Ras1会影响裂殖酵母孢子形态。

图4 裂殖酵母孢子形态图（100×10）

3 结论

野生型裂殖酵母在敲除基因 Ras1后，无论是在25 ℃还是37 ℃的恒温条件下连续培养12 h，3201菌株生长速度都要比野生型裂殖酵母缓慢，即敲除基因Ras1后会影响裂殖酵母的生长。敲除基因 Ras1后其产孢数目由原来的100 %产4个孢子到75 %产生1个孢子、25 %产生2个孢子，且孢子略小于野生型，即敲除这个基因会影响裂殖酵母产孢。综上所述，敲除Ras1会影响裂殖酵母的生长和产孢，但相关机制还有待进一步研究。