一株烟叶内源菌的鉴定及其在烟草提取物中的应用

卫 青，崔洪亮，曹 环，刘 鹤，马 林

(1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450002；2.云南瑞升烟草技术(集团)有限公司，云南昆明 650106)

随着烟草行业提出要加快培育以“高香气、高品质、低焦油、低危害”为主导的品牌体系，造纸法再造烟叶的应用更加广泛[1]。在卷烟配方中添加再造烟叶能够有效降低焦油[2-3]、苯酚[4]、NNK、NNN、NAB、NAT[5]等有害成分。然而，由于生产再造烟叶的主要原料是烟梗和碎烟，使其香气淡薄、刺激和杂气较重[6]，严重影响卷烟的感官品质，最终导致再造烟叶在卷烟中掺配比例很难达到10%以上。

烟叶经收获调制后，其表面存在大量微生物，且这些微生物贯穿烟叶发酵的始终[7]。特别是其中一些微生物能够直接或间接产生生物酶，可以将烟草原料中的多糖、蛋白质等大分子物质分解、转换成还原糖、氨基酸等小分子物质，这些小分子物质之间可以发生类似美拉德反应，从而促进致香成分的生成，提升感官品质[8]。利用微生物技术提高烟叶品质方面的研究已有较多报道[9-11]，然而这些研究大多集中在利用细菌[12-13]及酵母菌[14]等提高烟叶品质方面。直接利用真菌菌剂应用于造纸法再造烟叶烟膏，提高再造烟叶抽吸品质的研究还鲜少报道。笔者对一株烟草内源真菌进行鉴定，并利用该菌株菌剂处理再造烟叶烟膏，旨在探讨真菌菌剂提高再造烟叶烟膏品质的可行性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。2012年从红大烟叶中筛选获得一株产蛋白酶及多糖酶的真菌RSCT26，菌种现保存于云南瑞升烟草技术(集团)有限公司菌种库。

1.1.2培养基。菌种RSCT26活化和发酵所用培养基均为自制烟膏培养基。液体培养基为烟膏(云南中烟再造烟叶有限责任公司提供)100 mL，水900 mL，自然pH；固体培养基为烟膏100 mL，水900 mL，琼脂15 g，自然pH。

1.1.3仪器。OLYMPUS-BX51光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；ABS204-S电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)FW-400A高速粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；SKY-211B恒温培养振荡器(昆明纳瑞科技有限公司)；Eppendorf核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)；4N/7620401005紫外可见分光光度计(上海精密仪器有限公司)；KRK高浓盘磨(日本Kumagai Riki Kogyo公司)；AT-7890A/5975C Agilent GC-MS联用仪(美国Agilent公司)。

1.2方法

1.2.1RSCT26形态学鉴定。将菌株RSCT26活化，然后接种到装入10 mL固体培养基的培养皿中，7 d后观察菌落形态并测量菌落直径，并使用OLYMPUS-BX51光学显微镜观察孢子形态，根据《真菌鉴定手册》[15]和《真菌的形态和分类》[16]对菌株进行形态学鉴定。

1.2.2RSCT26分子鉴定。DNA提取采用CTAB法[17]，然后使用核酸蛋白测定仪测定提取DNA的浓度与纯度。真菌转录间隔区(ITS)PCR扩增引物采用ITS1-F与ITS4[11]，引物ITS1-F序列为5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS4序列为5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′。PCR反应体系(50 μL)如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，ITS1-F 1 μL，ITS4 1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，DNA模板(50～100 ng/μL)1 μL，ddH2O 39.75 μL。PCR反应程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。测序工作由北京华大基因生物有限公司完成。

将所获得的序列在NCBI网站(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站进行在线Blast序列比对，选择同源性高的序列作为参比对象，使用ClustalX 1.83软件进行多序列比对分析，采用临位相接法(Neighbor-joining)，应用MEGA 4.1软件构建系统进化树。

1.2.3RSCT26蛋白酶及多糖酶活的测定。RSCT26菌株活化，接入装有300 mL烟膏液体培养基的1 L三角瓶中，28 ℃、160 r/min发酵96 h，每8 h取样1次，10 000 r/min离心30 min，上清液过滤即得RSCT26菌剂，做3个平行样，按照GB/T 23527—2009方法测定RSCT26菌剂多糖酶及蛋白酶酶活。

1.2.4RSCT26菌剂在再造烟叶烟膏中的应用。按照图1再造烟叶生产工艺，取“1.2.3”制得的RSCT26菌剂，按5%质量分数添加到混合提取液中，40 ℃下处理60 min，灭活，浓缩获得烟膏，涂布，切丝，制样，对照样为等比例添加灭活菌剂，其他试验步骤与试验样品一致。

图1 RSCT26菌剂处理工艺流程Fig.1 The process flow of RSCT26 preparation

1.2.5化学常规成分及致香成分的测定。按照烟草行业标准方法YC/T 159—2002、YC/T 160—2002、YC/T 161—2002、YC/T 162—2002、YC/T 217/2007、YC/T 166—2003测定烟膏中可溶性总糖、还原糖、总植物碱、总氮、氯、钾及蛋白质含量。致香成分的检测采用GC-MS联用仪法[18-19]。数据统计与分析使用Excel 2010软件和SPSS 19.0统计软件进行。

1.2.6感官评价。取“1.2.4”中所得样品手工打烟，恒温恒湿[(22±1)℃、(60±2)%]平衡48 h，组织云南瑞升烟草技术(集团)有限公司的专家组按照烟草行业标准YC/T498—2014对再造烟叶样品进行感官品质评价。

2 结果与分析

2.1菌株RSCT26的形态学鉴定对分离纯化的菌株RSCT26进行培养，经观察发现RSCT26菌落呈圆形，黑褐色，培养7 d直径约5.5 cm。在OLYMPUS-BX51光学显微镜下制片拍照，如图2所示，菌丝有横隔，孢子梗从菌丝生出，直或弯曲，单生，分隔，分枝，分生孢子呈倒梨形、倒棒状或近椭圆形，具有3～5个横隔，具有纵、斜隔，分隔处略有缢缩，孢子大小约15.0 μm×6.0 μm。经初步鉴定，确定其为链格孢属真菌。

图2 菌株RSCT26的孢子形态Fig.2 Spore morphology of RSCT26 strain

2.2菌株RSCT26分子鉴定将菌株RSCT26的ITS区序列用BLAST软件与GenBank数据库中已发表的ITS区序列进行同源性比较，选取同源性在95%以上的9株真菌，以PyrenochaetopsispoaeKJ869117为外群，构建系统发育树(图3)。由图3可知，菌株RSCT26与已报道的链格孢属真菌(Alternariaalternata)亲源关系最近，且有99%以上的相似性。这也表明菌株RSCT26在分类学地位上归属于链格孢属，结合“2.1”中形态学鉴定结果，将菌株RSCT26鉴定为链格孢属真菌(Alternariaalternata)。

图3 菌株RSCT26的ITS区系统发育树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of RSCT26 based on ITS region

2.3多糖酶及蛋白酶酶活菌株RSCT26发酵96 h，每8 h取样并检测多糖酶及蛋白酶酶活，结果见图4。从图4可以看出，随着发酵时间的增加，2种酶酶活不断升高。多糖酶酶活在64 h时达到最大值(482.12 U/mL)，保持12 h左右，然后开始降低；蛋白酶在72 h基本达到峰值(47.89 U/mL)，直到96 h基本变化不大；2种酶在发酵72 h时基本都处于酶活峰值，因此在后续试验中选取该时间点来获取菌剂。

图4 菌株RSCT26的蛋白酶和多糖酶酶活Fig.4 The protease and polysaccharidase activities of RSCT26 strain

2.4RSCT26菌剂处理后烟膏化学常规成分及致香成分的变化RSCT26菌剂处理后烟膏化学成分变化如表1所示。由表1可知，与对照样相比，RSCT26菌剂处理后几种主要有机质成分含量发生了显著变化，烟膏中可溶性总糖和还原糖含量显著增加，蛋白质和总氮含量降低，RSCT26菌剂多糖酶酶活较高，多糖酶将烟膏中的多糖分解为还原糖和二氧化碳，蛋白酶分解蛋白质转化为氨基酸，而且这些还原糖与氨基酸发生美拉德反应，形成致香物质[20]，二氧化碳挥发进入空气，最终表现为可溶性总糖和还原糖含量增加，蛋白质和总氮含量有一定幅度降低；其他化学成分(如钾离子、总植物碱、氯离子)变化不大。郑勤安[21]利用2种菌及1种蛋白酶混合配制成的烟草发酵增质剂处理烟草原料萃取浓缩液，可溶性总糖和还原糖含量增加，蛋白质含量降低，烟草品质得到很大提升，此结果与该研究结果相一致。

烟草中糖类和氨基酸发生美拉德反应的主要产物杂环类化合物是烟草香味的主要来源之一，能够增加坚果香、烘烤香、焦糖香等香味[21]。通过GC-MS对烟膏致香成分的含量进行检测，结果见表2。RSCT26菌剂处理后烟膏中杂环类化合物增幅最大，达到64.930%。有机酸类物质也是烟草中一类重要的香味成分，等级越高、品质越好的烟叶有机酸含量越高[22]，而且在烟草发酵过程中微生物分解果胶和木质素等大分子化合物也可以产生有机酸[21]。RSCT26菌剂处理后烟膏中糠酸和棕榈酸含量均大幅度增加，有机酸类物质总量增加53.530%。RSCT26菌剂处理后烟膏中一些重要致香成分(如二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮、金合欢基丙酮、二氢大马酮等)均有一定程度增加。此外，RSCT26菌剂处理后烟膏中酮类化合物、醇类化合物和醛类化合物含量均有不同程度增加，而致香成分总量增加21.559%，表明RSCT26菌剂处理有利于增加烟膏中致香成分总量，从而提高烟膏的品质。

表1 RSCT26菌剂处理后烟膏化学常规成分的检测结果

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

Note：Different lowercase letters in the same column indicated significant differences(P<0.05)；Different capital letters in the same column indicated significant differences(P<0.01)

表2 RSCT26菌剂处理后烟膏致香成分检测结果

接下表

2.5感官评价对RSCT26菌剂处理与未处理的烟膏进行再造烟叶中应用，并进行感官评价，结果表明RSCT26菌剂处理后，与对照样品相比再造烟叶产品香气质较好、香气量较足，刺激和杂气方面都有所改善，但在香气丰富性上依然有所欠缺。

3 结论

通过形态学及分子生物学相结合的手段，将菌株RSCT26鉴定为链格孢属(Alternariaalternata)，该菌株发酵72 h多糖酶及蛋白酶酶活达到峰值，用该菌株菌剂处理再造烟叶烟膏，与对照相比，处理后烟膏可溶性总糖和还原糖含量显著增加，总氮和蛋白质含量显著降低，几大类主要致香成分含量均显著增加。感官评价结果表明，RSCT26菌剂处理后再造烟叶香气质变好，香气量变足，刺激和杂气变小。大量研究表明，链格孢属真菌大多为烟叶致病菌，将该菌株应用于生产时还需对其安全性进行进一步应用评价。