小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体标本制备方法的优化

高振华，吴浩浩，赵志辉，许英梅，Aguzey Harry，程贵兰，生 冉，许嫣红

(广东海洋大学农学院，广东湛江 524088)

细胞染色体是细胞核中稳定且重要的成分，是生物遗传物质的载体，其数目与形态是研究生物进化、遗传变异、个体发育、疾病预防、病因发生、疾病诊断和治疗等的基础手段[1-3]。染色体标本的制备是进行染色体核型分析、带型分析和检测遗传学相关疾病的前提[4-7]。小鼠因其繁殖周期短、产仔数多、成熟早、个体小、易操作、成本低且与人类基因相似度高等特点[8-10]，是人类疾病研究的首选动物模型，骨髓细胞因数量多、取材方便、分裂增殖性强、不需要进行无菌操作和体外培养，方法简捷而成为进行染色体标本制备的理想材料[11-13]，也是各高校用于细胞遗传类教学的首选实验方法。仅从低渗处理步骤开始至染色前，所需要的时间大约140 min，耗时长，从而导致学生实验不好安排，人们也在尝试优化和改进实验方法，以减少实验持续时间，但以前的研究大多集中于取样部位的选取、离心条件改变、低渗溶液浓度改变、固定液浓度改变等[14-17]，固定次数和固定时间对实验时间的影响研究鲜见报道。为此，笔者对制片操作过程中的固定环节进行了适当优化，以缩短操作时间。

1 材料与方法

1.1实验动物选择4～8周龄小鼠，性别不限。

1.2器材与试剂

1.2.1器材。解剖板、解剖剪、大小镊子、吸管、离心管、培养皿、预冷载玻片、酒精灯、擦镜纸、恒温水浴箱、TDL-5 型离心机。

1.2.2试剂。秋水仙素200 μg/mL、2%柠檬酸钠溶液、0.075 mol/L KCl 低渗溶液、甲醇乙酸(3∶1)固定液、Giemsa 染液。

1.3方法

1.3.1预处理。在预实验的基础上，共选取4～8周龄的健康小鼠201只，公母不限，随机分为3组，分别1次固定38只(60 min)、2次固定123只(30、25 min))和3次固定41只(30、25、15 min)，其他操作步骤不变。具体操作步骤按照《动物遗传学实验教程》[18]进行。

1.3.2实验程序。①注射秋水仙素：在试验开始前3～4 h 给小鼠腹腔注射秋水仙素，注射剂量为每只小鼠注射200 μg/mL的秋水仙素0.4 mL。②处死小鼠，收集骨髓细胞：采用颈部移位法处死小鼠，后腿中间剪开皮肤和肌肉，从后肢根部取出股骨置于培养皿中，分离去除附在骨上的肌肉。用2%柠檬酸钠清洗干净，剪掉股骨两端股骨头，暴露骨髓腔，用注射器吸取2%的柠檬酸钠5 mL，反复冲洗骨髓腔至股骨变白，将冲洗液置于离心管中离心，去除上清液留沉淀。③低渗处理：在细胞悬液中加入5 mL 0.075 mol/L的 KCl溶液6 mL，将细胞吹打1次，在37 ℃下水浴30 min，中间吹打1次；1 000 r/min离心10 min。④固定：加入3∶1的甲醇-冰醋酸固定液进行固定，具体方法包括1次固定(60 min)、2次固定(30、25 min)和3次固定(30、25、15 min)。最后一次固定后离心，弃去上清液，加入3∶1的甲醇-冰醋酸固定液2～3滴(视细胞数量适当增减，大约相当于 5倍细胞的体积)，摇匀制成细胞悬液。⑤滴片：取事先预冷(-20 ℃)的载玻片，迅速从约30 cm 高处滴加细胞悬液1～2 滴，轻轻吹散，酒精灯上过火2～3次(切勿过热烤干)，风干。⑥染色：取风干后的薄片置于玻璃板上，滴满Gimesa染液(0.5 mL Gimesa原液加入9.5 mL 0.01 mol/L PBS，pH 6.8)于载玻片上，染色30 min后用蒸馏水冲洗，晾干后观察。

1.4数据处理数据以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著；采用Duncan’s多重比较进行显著性分析。

2 结果与分析

对固定环节进行优化，分为3种固定方法，具体结果见表1。

表1 不同固定方法的效果比较

注：同列不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)

Note：Different small letters in the same column indicated significant differences(P< 0.05)

1次固定染色体制片成功率为75.00%，制片效果不佳，染色体不清晰，重叠，排列不整齐，过于分散不集中；2次固定染色体制片成功率为82.10%，染色体数目清楚，结构清晰，分散充分而适度，没有叠加；3次固定染色体制片成功率为82.90%，染色体长度适中，数目分明，染色体形态可见，整齐排列不叠加。从制片成功率和和染色体标本制备的质量来看，2次固定和3次固定的效果均好于1次固定，且2次固定和3次固定的效果差异不明显(P<0.05)。3种固定方法的视野中骨髓细胞数量差异不显著。染色体中期分裂相细胞数量的变化与视野中骨髓细胞数量相一致，多次固定的效果也显著优于1次固定(P<0.05)。

3 讨论

小鼠骨髓细胞的染色体制备是细胞遗传学、细胞工程类课程的基本实验方法，用于染色体结构和功能分析及操作，从秋水仙素的注射、骨髓细胞的获取以及低渗处理、固定及滴片的环节都要求精细操作，但固定操作环节耗时最长，一般教材提供的方法大多是3次固定，固定时间分别为30、25和15 min，在每次固定后需要离心10 min，仅固定环节就耗时100 min。因此，基于HACCP(危害分析与关键点控制)理论分析，固定次数和固定时间是制约整个实验的关键因素，直接影响实验所用时间的长短，也是实验程序优化的关键环节，因此在多次预实验后确定可行的3个固定程序。该研究发现，1次固定效果不佳，染色体形态模糊不清，染色体易离散不集中，染色体边缘起毛等现象导致观察效果不佳，不适用于染色体核型分析。研究表明，无论是小鼠骨髓细胞、蟾蜍骨髓细胞等动物的同一部位染色体制备，还是小鼠不同部位的细胞，大多采用2次固定或3次固定。这可能是因为1次固定甲醇-冰醋酸固定液未能充分透过细胞膜发挥作用，影响制备效果。经观察发现，采用2次固定和3次固定时，标本均着丝点位置清晰，染色体明显伸展、不缠绕，排列整齐，形态清楚可见。制备麻雀、鹌鹑骨髓细胞和羊水细胞的染色体标本[14-17]等采用了2次固定，而用3次固定制备小鼠雄性生殖细胞染色体标本[18]也能获得清晰的染色体样本，说明2种固定方法在试验操作中均获得较理想的效果。究其原因，这可能是因为多次固定可使固定液与细胞充分混匀并进入细胞，对染色体起到固定作用，防止染色体蛋白质自溶，并能增强染色体的嗜碱性，使染色体形态清晰，能够很好地分散[19-22]，提高染色体结构的可见度，改善对小鼠骨髓染色体核型分析的观察效果。然而，从操作时间来看，2次固定用时75 min，比3次固定所需时间(100 min)减少了25 min，节省了时间，便于课堂的实验安排。从节约时间、提高效率、节省人力等综合因素考虑，制备小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体标本的最佳固定方法为2次固定。

固定的目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便进行下一步处理，防止细胞内蛋白质分解导致结构变化。冰醋酸渗透力强，固定迅速，可阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏，但易使组织膨胀。甲醇能迅速穿透组织使组织收缩，2种溶液按一定比例混合，既能保证固定效果，又能保证染色体的铺展。但若固定时间太长，可能会导致细胞破裂、染色体片段的过分膨胀及染色体散失。这也是一次长时间固定的观察中细胞总数和分裂相细胞少的原因。

动物实验程序是一个不断完善的过程，在进行该实验时发现多个步骤尚有待进一步优化与探索。

4 结论

小鼠骨髓细胞有丝分裂染色体标本制片可采用2次固定的方法，固定时间分别为30、25 min。