感染H3N2亚型SwIV荣昌仔猪组织脏器的损伤及其载毒分析

朱买勋，张邑帆，付利芝，徐登峰，周 雪

(重庆市畜牧科学院，农业部养猪科学重点实验室，重庆 荣昌 402460)

【研究意义】猪流感(Swine influenza)是由猪流感病毒(swine influenza virus，SwIV)引起的一种人畜共患病。该病毒在病毒感染、增殖过程中容易引起病毒免疫逃逸，可能引起病毒侵袭宿主的受体结合位点发生生物学活性改变，能不同动物种源间传播，侵害其免疫系统，影响生长发育，严重危害猪、禽、人的健康。【前人研究进展】SwIV属于正黏病毒科的A型流感病毒，是一种温和型、高传染性的呼吸道疾病，临床上以发热、厌食、呼吸困难、咳嗽等临床症状为主，未出现其他的典型症状。在我国已经发现的流感病毒亚型有H1N1、H3N2、H1N2、H9N2、H5N1等，在猪群间广泛流行的流感病毒有典型猪H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2亚型毒株[1-2]。猪只在短暂感染猪流感病毒后，其先天性免疫系统在受到侵害的同时，还会激发机体的免疫防御系统，促进组织细胞分泌抗病毒类细胞因子，如干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素等，参与机体的抗病毒作用，使患病猪在短期内快速恢复[3-5]。给仔猪滴鼻感染H3N2病毒，在感染病毒后第5天特异性sIgA的抗体水平会迅速升高，积极的参与机体的免疫应答[6]。如果病毒的毒力较强或者病毒的持续感染，会严重损伤猪的免疫系统，抑制感染猪的生长发育，增强猪对疾病的易感性。在体外用SwIV分离株感染猪肺巨噬细胞，72 h后细胞形态发生改变，凋亡细胞达25 %，推测SwIV可以诱导猪肺巨噬细胞凋亡，导致机体免疫抑制[7]。H3N2亚型流感病毒还会出现抗原漂移现象，引起宿主免疫逃逸，形成新的流行[8]。在防治过程中，主要方式是接种疫苗进行免疫，SwIV对烷胺类药物有明显的耐药性[9]。 【本研究的切入点】重庆是西南地区养殖业比较集中地区，养猪业占据了主要部分，每年因疾病造成了巨大的损失。SwIV感染猪群一般不会有典型的临床征兆，还未来得及进行疾病治疗就造成动物的损伤，影响养猪业的生产。但是SwIV在重庆地区的流行调查还未受到重视。【拟解决的关键问题】为了明确H3N2型SwIV对仔猪组织脏器引起的损伤变化，本研究使用H3N2型SwIV人工感染仔猪，分析该病毒对荣昌仔猪组织脏器的损伤及其在组织中的载毒情况，可以使临床中实施SwIV防治更有针对性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验动物和病毒 试验仔猪，荣昌猪品系，25日龄，购自重庆市育种猪场；鸡胚，SPF级，10日龄，购自济南斯派瑞福禽业科技有限公司，生产许可证号：SCXK(鲁)2014 0005；猪流感病毒，H3N2亚型，由重庆市畜牧科学院兽医研究所分离鉴定，并做保存[10]。

1.1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒，Solarbio公司产品； One step RT-PCR Kit，宝生物工程(大连)有限公司产品，Swine Infuenza (H1N1) Antibody Test Kit、Swine Infuenza (H3N2) Antibody Test Kit，BIOVET公司生产。

1.2 病毒的增殖培养

选用10日龄的SPF鸡胚，用铅笔画出气室和胚位，在气室接近胚体处消毒后，用钢锥穿一小孔，接种0.2 mL H3N2猪流感病毒液，石蜡封口，并置于孵化箱孵育，保持温度(37±1) ℃，湿度50 %～60 %，每天检胚2次，弃除24 h内死亡鸡胚，24～72 h内死亡的胚胎置4 ℃冰箱30 min，收集尿囊液，收获的尿囊液无菌检验后在-80 ℃冰箱中保存。

1.3 病毒的鉴定

参照GenBank，选择H3N2亚型SwIV毒株的HA基因序列(No.AF251419)设计引物，上游引物SwIV1：5’-GTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’，下游引物SwIV2：5’-CCTCTAGTTTGTTTCTCTGGTAC-3’，按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，按RT-PCR一步法试剂盒要求，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μl，Buffer 25 μl，上下游引物各1 μl，RNA模板5 μl，加ddH2O补足50 μl，反应程序为：50 ℃ 30 min； 94 ℃ 2 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， 30个循环，75 ℃延伸10 min，取5 μl PCR产物进行电泳分析，预期产物1065 bp。

1.4 病毒半数感染量测定

参照Reed-Muench法[11]，用病毒稀释液把培养所得尿囊液进行10倍梯度稀释，从10-1稀释至10-10，共10个稀释度，每个稀释度接种9～11 d 的SPF鸡胚5枚，接种量为0.1 mL/枚，37 ℃温箱培养，逐日观察至120 h，期间死亡的鸡胚及时拿出冷藏4 h或过夜，收获每枚鸡胚的尿囊液，分离。用1 %鸡红细胞悬液做血凝试验，逐枚检测鸡胚尿囊液中病毒的血凝价，当HA≥1∶128时判为感染，根据血凝价计算EID50。

1.5 仔猪感染SwIV病毒

在试验前，前腔静脉采集仔猪血液2～3 mL，分离血清，采用ELISA检测仔猪血清猪流感H1N1和H3N2抗体，选择抗体为阴性仔猪进行感染病毒。选择6头H1N1和H3N2抗体均为阴性的仔猪，随机分为试验组和对照组，每组3头，试验组滴鼻攻毒H3N2 SwIV 5 mL/只，对照组滴鼻5 mL生理盐水，观察仔猪临床症状。

1.6 临床检查及病理学观察

猪流感潜伏期为1～3 d，持续感染6～7 d，试验选择在接种病毒后第5天剖杀试验仔猪，检查仔猪组织脏器的临床变化。取病理变化较为严重的组织，用10 %甲醛固定，参照文献操作，进行组织切片的制作[12]。制作好的切片采用显微成像系统进行拍照记录组织损伤变化。

1.7 仔猪组织载毒检测

采集心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等组织，剪成2～3 mm2组织块，迅速置于液氮中提取总RNA，反转录为cDNA，PT-PCR检测猪流感病毒在心、肝、脾、肺、肾和淋巴结中的载毒量。

2 结果与分析

2.1 SwIV增殖及鉴定

SwIV接种SPF鸡胚后，24 h内死亡3枚，检查发现胚体质软易碎，全身出血；24～72 h内死亡42枚，收集尿囊液约380 mL，-80 ℃保存，胚体弱小，全身出血；对照组鸡胚直至72 h未死亡，鸡胚正常发育，已长出绒毛。从收集的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，用HA引物进行RT-PCR扩增，在1065 bp处出现目的条带(图1)，与预期结果相符合，说明收集的病毒液为目的病毒。

表1 H3N2感染鸡胚结果

2.2 SwIV效价测定

病毒液经血凝试验检测出各个稀释度病毒液的鸡胚感染数(表1)，Reed-Muench法统计得出病毒液EID50为106.5/mL。

2.3 感染H3N2型SwIV仔猪的临床和病理学变化

接种病毒后，试验组仔猪体温升高，有轻微腹泻，食欲正常，精神不振。剖解试验组仔猪发现肺脏边缘淤血，表面有损伤坏死(图2，见封三)；其他组织未见典型病变。取肺组织制作石蜡切片，观察结果显示试验组仔猪肺泡壁增厚，肺泡内有纤维性渗出和炎症细胞聚集，对照组仔猪肺泡完整，无异常变化(图3，见封三)。

2.4 感染仔猪的载毒检测

经RT-PCR检测，在试验组仔猪肺脏样品中检测出H3N2型 SwIV，而心、肝、脾、肾脏和淋巴结检测结果均为阴性(图4)，说明H3N2型 SwIV主要感染于仔猪的肺脏组织。

3 讨 论

猪流感是由A型流感病毒引起的急性呼吸道疾病，在猪群间基本没有其流行的临床征兆。SwIV侵入机体时，在呼吸道和消化道黏膜上皮细胞内进行增殖，随着病毒的增殖和损伤，引起动物精神倦怠，咳嗽，食欲不振等轻微的临床症状。这个时候会激起机体的免疫，最终形成自然恢复的现象。如果病毒的持续感染，导致上皮细胞感染，进一步损伤组织器官，要表现出典型的组织病变和相应的症状，流感病毒浓度值必须达到一定的量。试验中仔猪在滴鼻接种H3N2亚型SwIV后，仔猪未出现典型的临床症状，但是肺脏组织已经受到严重的损伤，肺泡壁增厚，肺泡内有纤维性渗出和炎症细胞聚集。分析原因可能是病毒在肺脏组织中进行扩散，形成感染，造成组织损伤。但是病毒的量还只局限于局部脏器的损伤，流感病毒还没有通过血流侵入血流中致使机体发生典型的临床症状。

1：阳性对照；2：病毒液1: Positive control; 2: Viral solution图1 猪流感HA基因RT-PCR结果 Fig.1 RT-PCR result of SwIV HA gene

对感染H3N2型 SwIV组织载毒情况分析，在肺脏组织中检测到病毒，脾脏、肝脏、肾脏、心脏、淋巴结中均没有检测到SwIV，说明H3N2型 SwIV在感染仔猪时病毒主要蓄积在肺脏组织。大量的SwIV聚集在肺脏组织中，由于肺部病毒诱导的细胞因子产量不高，机体表现出轻微感染症状，病毒在呼吸道的含量及达到产生感染性病毒的细胞因子的程度，但是机体经过免疫刺激后，流感病毒中原有的抗病毒的细胞因子消失[13]。

1：心脏；2：肝脏；3：脾脏；4：肺脏；5：肾脏；6：淋巴结1: Heart; 2:Liver; 3: Spleen; 4: Lung; 5：Lidneys；6: Lymph nodes图4 仔猪组织中H3N2猪流感病毒HA基因检测Fig.4 RT-PCR result of major organs in pigs infected with H3N2 SwIV

结合H3N2型 SwIV感染仔猪的临床变化和组织病理学分析，在防治SwI的时候，虽然临床上还未表现出典型的临床症状，但可能已经造成了组织器官的损伤，且H3N2型 SwIV主要载毒在肺脏组织中，临床治疗过程中应当注意组织器官的修复，尤其是肺脏组织。此外，由于传播方式比较广，还要注意疫苗进行预防，应该加强对SwIV的长期监控，做到疾病净化，防止SwI在人畜间的传播[14]。

4 结 论

本研究结果显示感染H3N2型SwIV仔猪不一定出现典型临床症状，但其组织受到严重损伤，且主要载毒于肺脏组织。