微小RNA-3915在肾癌中的表达及对肾癌细胞迁移和侵袭的影响

李建新 邓全红 朱文 刘波 沈旭

肾癌是泌尿系统常见的一种恶性肿瘤，且肾癌的发病率不断升高。肾癌的主要治疗方式为手术治疗，但较高的复发率和早期转移严重影响患者的预后[1]。寻找一种可早期诊断肾癌的生物学标志物和治疗靶标，对肾癌的临床治疗具有重要的意义。微小RNAs(miRNAs)是一种存在于真核生物的非编码RNA，是长度仅为18～25 nt的小分子单链RNA[2]。miRNAs既可作为一种癌基因，也可作为一种抑癌基因[3]。miRNAs的异常表达可促进肾癌的恶性发展，众多miRNA被证实与肾癌的病理过程显著相关[4]。本研究对肾癌组织中多个miRNA的表达进行了筛选分析，发现miR-3915在肾癌组织中异常表达。miR-3915是一种未见研究报道的miRNA，故本研究以miR-3915为研究对象，观察进一步下调miR-3915的表达后其对肾癌细胞迁移和侵袭的影响，并通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验，探讨了miR-3915的作用机制。

材料与方法

一、材料

14例肾癌及癌旁组织标本来自我院泌尿外科，本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。人正常肾小管上皮细胞株(HK-2)和肾癌癌细胞株(A498、OS-RC-2、ACHN、786-O)购自中国典型培养物保藏中心；miR-3915模拟物、miR-3915抑制序列(3′-AACTCCTTTTCTACCAGAATAA-5′)、阴性对照序列(miR-NC)、野生型pGenesil-1.1-CMTM3质粒(CMTM3-WT)、突变型pGenesil-1.1-CMTM3质粒(CMTM3-MUT)购自上海GenePharma公司；DMEM高糖培养液、RPMI 1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；PCR试剂盒购自宝生物(大连)公司；Trizol试剂和Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；CMTM3、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug和β-actin单克隆抗体购自美国CST公司；引物购自上海生工生物工程公司；24孔板Transwell小室购自美国Corning公司；基质胶购自美国BD公司。

二、细胞培养和瞬时转染

细胞的培养条件为37 ℃、5% CO2，正常肾小管上皮细胞株HK-2在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，肾癌细胞株A498、OS-RC-2、ACHN、786-O在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养。将A498细胞接种于6孔板，待培养至60%～70%，根据Lipofectamine 3000说明书进行转染操作。转染miR-3915抑制序列组命名为实验组，转染阴性对照序列(miR-NC)组命名为对照组。转染后24 h更换为新鲜培养液。

三、RNA提取与实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)

Trizol法提取组织和细胞总RNA，分光光度计检测总RNA浓度，反转录RNA为cDNA，利用PCR试剂盒进行qRT-PCR扩增检测。miR-3915正向引物为5′-GGGGATGTTGAGGAAAAGATGGT-3′，反向引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物为5′-TCCGATCGTGAA-GCGTTC-3′，反向引物为5′-GTGCAGGGTCCG-AGGT-3′；GAPDH正向引物为5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物为5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′；CMTM3正向引物为5′-CGGCCCTCATCTACTTTGCTA-3′，反向引物为5′-GCCACGTCGTTAAAGATCAGGT-3′。以U6 RNA作为内参检测miR-3915的表达水平，以GAPDH作为内参检测CMTM3的表达水平，采用2-△△Ct法分析miR-3915在肾癌组织和细胞株中的表达量。

四、双荧光素酶报告基因实验

生物信息学预测软件MicroT-CDS和miRanda预测显示，CMTM3基因3′UTR含有miR-3915的结合序列(图1)。将miR-3915或miR-NC和CMTM3-WT、CMTM3-MUT共转染至A498细胞，分组为miR-3915+CMTM3-WT、miR-NC+CMTM3-WT、miR-3915+CMTM3-MUT和miR-NC+CMTM3-MUT，连续培养48 h。以海肾荧光素酶荧光值作为对照，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分析A498细胞的荧光素酶活性。

图1 miR-3915与CMTM3基因互补结合区域

五、Western blot

转染48 h后，预冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，采用蛋白裂解液裂解并提取细胞总蛋白，两组取等量蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜，质量分数为3%的脱脂牛奶室温下封闭2 h，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBST溶液)洗膜后，分别与一抗CMTM3、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug和β-actin在4 ℃孵育12 h。TBST溶液洗膜后，与相应的二抗在室温下孵育3 h，采用增强化学发光试剂在凝胶成像系统中显影，拍照并分析。

六、Transwell迁移实验检测细胞迁移能力

转染48 h后，将两组A498细胞胰酶消化后，采用无血清培养液重悬，200 μl/孔接种至24孔板Transwell上室，下室加入600 μl完全培养液，连续培养24 h。取出上室，甲醛固定后，用棉签擦去未迁移的细胞，结晶紫溶液染色，流水洗去多余染液。光学显微镜下随机取6个视野拍照，计数迁移细胞数并取平均值。

七、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

转染48 h后，将基质胶预铺在24孔板Transwell上室，培养箱内风干4 h后取出。将两组A498细胞胰酶消化后，采用无血清培养液重悬，200 μl/孔接种至24孔板Transwell上室，下室加入600 μl完全培养液，连续培养24 h。取出上室，甲醛固定后用棉签擦去未侵袭的细胞和基质胶，结晶紫溶液染色，流水洗去多余染液。光学显微镜下随机取6个视野拍照，计数侵袭细胞数并取平均值。

八、统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，两组样本均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、肾癌组织和肾癌细胞株中miR-3915表达上调

相对于癌旁组织，14例配对肾癌组织中miR-3915的表达量明显增加(P<0.01)。见图2。相对于正常肾小管上皮细胞，miR-3915在肾癌细胞株中的表达均增加(P<0.05)，其中A498细胞中增加最明显(P<0.01)。见图3。

二、miR-3915抑制序列对A498细胞中miR-3915表达的影响

miRNA-3915抑制序列和阴性对照序列miR-NC转染A498细胞，与对照组相比，实验组A498细胞中miR-3915表达显著降低[(1.01±0.06)∶(0.21±0.03)，P<0.01]。见图4。

图2 qRT-PCR检测肾癌组织中miR-3915的表达(与癌旁组织比较**P<0.01)

图3 qRT-PCR检测正常肾小管上皮细胞和癌细胞中miR-3915的表达(与HK-2比较*P<0.05；**P<0.01)

图4 qRT-PCR检测两组细胞中miR-3915的表达(与对照组比较**P<0.01)

三、miR-3915对CMTM3基因的结合作用验证

双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-3915和CMTM3-WT共转染后细胞荧光素酶活性明显低于miR-NC和CMTM3-WT共转染(P<0.01)；miR-3915或miR-NC和CMTM3-MUT共转染后细胞荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

四、转染miR-3915抑制序列对CMTM3基因表达的影响

qRT-PCR显示，与对照组相比，实验组细胞中CMTM3 mRNA表达明显上调[(1.00±0.11)∶(4.83±1.32)，P<0.01]。Western blot结果显示，转染miR-3915抑制序列后，CMTM3、E-cadherin和β-catenin蛋白表达升高，Vimentin和Slug蛋白表达降低。见图6。

图5 双荧光素酶报告基因实验验证miR-3915对CMTM3的结合作用(与miR-NC比较**P<0.01)

五、miR-3915抑制序列对A498细胞迁移能力的影响

Tranwell迁移实验结果显示，实验组穿过24孔板Tranwell上室的A498细胞数显著少于对照组[(58.79±14.65)∶(170.90±16.64)，P<0.01]，表明miR-3915抑制序列具有抑制肾癌细胞A498迁移的作用。见图7。

图6 下调miR-3915表达后A498细胞中CMTM3和上皮间质转化相关蛋白的表达量

六、miR-3915抑制序列对A498细胞侵袭能力的影响

Tranwell侵袭实验结果显示，实验组穿过24孔板Tranwell上室的A498细胞数显著少于对照组[(44.10±8.34)∶(91.38±9.54)，P<0.01]，表明miR-3915抑制序列具有抑制肾癌细胞A498侵袭的作用。见图8。

A:柱状图；B：实验结果

A:柱状图；B：实验结果

讨 论

近年来的研究发现，miRNAs在细胞增殖、凋亡、衰老、分化及转移等生物学功能中发挥重要作用[5]。miRNA主要通过结合靶基因mRNA的3′端非编码区，形成沉默复合物，抑制靶基因mRNA的翻译或者直接导致靶基因mRNA的降解，属于转录后水平的调控[6]。在肾癌中多种miRNA如miR-212、miR-200a、miR-30a-5p、miR-210-3p均存在表达异常，参与调控肾癌的增殖、迁移和侵袭，可作为肾癌增殖和转移的治疗靶点及早期诊断标志物[7-10]。关于miR-3915的研究未见报道，特别是其在肾癌中的表达及作用机制尚不清楚。因此，探讨miR-3915对肾癌迁移、侵袭的影响可能为抑制肾癌进展提供新的分子靶标。

本研究结果显示，相较癌旁组织和正常肾小管上皮细胞株，miR-3915在肾癌组织和肾癌细胞株中的表达明显增加，提示miR-3915在肾癌中可能是一种癌基因。本研究通过生物信息学预测软件MicroT-CDS和miRanda发现，miR-3915的靶基因可能是CMTM3。CMTM3基因是CMTM基因家族的一员，在胃癌、前列腺癌等多种肿瘤组织和细胞株中呈低表达[11-12]。CMTM3蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖、分化和转移等恶性生物学行为，对肿瘤的发生、发展具有显著的抑制作用[13]。CMTM3蛋白在肾癌中表达降低，研究显示其可发挥明显的抑癌作用，提示CMTM3可能成为肾癌潜在的治疗靶点和诊断标志物[14]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验发现，miR-3915和CMTM3-WT共转染后细胞荧光素酶活性显著低于miR-NC和CMTM3-WT共转染的细胞，而miR-3915或miR-NC和CMTM3-MUT共转染后细胞荧光素酶活性差异无统计学意义，提示miR-3915可直接结合CMTM3。上皮间质转化是指细胞的上皮表型在某些条件下转化为间质表型的生物学过程，是细胞获得转移能力的重要机制，上皮间质转化过程涉及E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Slug等蛋白表达的改变[15-16]。低表达miR-3915后，E-cadherin和β-catenin蛋白的表达增加，Vimentin和Slug蛋白的表达降低，表明肾癌A498细胞的上皮间质转化过程受到抑制，细胞转移能力降低。为了研究miR-3915在肾癌进展中的作用，本研究在A498细胞中下调miR-3915的表达，通过Transwell实验发现低表达miR-3915可抑制A498细胞的迁移和侵袭，提示miR-3915可能在肾癌的迁移和侵袭中发挥重要的促进作用。

本研究结果表明，下调miR-3915的表达水平后，肾癌细胞A498的增殖和迁移能力均显著降低。miR-3915可能通过下调CMTM3基因的表达，促进肾癌细胞A498的增殖和迁移，为肾癌的防治研究提供了一定的实验基础。