红花注射液对野百合碱损伤血管内皮细胞NO活性、内皮型NO合成酶及结缔组织生长因子表达的影响

陈爱凤 丁士标 林旭瑷 孔亮亮 徐俭朴

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是多种病因引起的以肺动脉压和肺血管阻力进行性增高为特征的综合征。肺血管收缩、重构和原位血栓形成是PAH形成和肺循环血流动力学改变的基础，持续发展可导致右心衰竭和死亡[1]。PAH的病理改变主要包括内皮细胞的损伤和凋亡、中膜肥厚、炎症细胞浸润和肺小动脉血栓形成[1-2]。肺血管内皮细胞损伤和功能紊乱在PAH的发生和发展过程中起着关键性作用，表现为细胞一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase，NOS）分泌减少，结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、内皮素-1和血栓素分泌增加[3-4]。目前的现代医学治疗方法只能起到改善症状，提高生活质量的目的，因此，亟需寻找更有效的治疗方法。红花是传统的中草药，其注射液由红花提取精制而成，主要含有查耳酮类、漆树黄酮、桑叶素、槲皮素、杨梅素等成分，具有抗氧化、抗凝、防止血栓形成、抗炎症因子、抗氧自由基和扩张血管、调节血管平滑肌细胞增殖等作用[5]。本研究通过检测红花注射液对野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导人血管内皮细胞（human vascular endothelial cells，HUVECs）损伤模型中NO、内皮型NO合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、CTGF等形成的影响，探讨红花注射液对PAH的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 材料 MCT购自美国Sigma公司（批号：C2401-1G）。将 MCT溶于 1.0mol/L 盐酸，用1.0mol/L NaOH调节pH值至7.2，并调整浓度为20mg/ml。红花注射液购自山西华卫药业有限公司（国药准字Z14020008，批号：15010515）。抗eNOS多克隆抗体（批号：32027S）、抗β-actin单克隆抗体（批号：abs118937）、抗 CTGF 抗体（批号：86641S）购自上海优宁维生物科技有限公司。总NO检测试剂盒（批号：S0024）购自上海碧云天生物技术有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（批号：RR047A），TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ荧光定量PCR试剂盒（批号：RR820Q）购自大连宝生物科技有限公司。NO敏感性荧光材料二乙酰·二氨基荧光素（DAF-2/DA）购自美国Sigma公司（批号：FCANOS）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 HUVECs购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，采用含10%FBS的RPMI-1640培养液在37℃、5%CO2条件下培养。其中MCT组、红花注射液组在初始培养时加入终浓度为1μmol/L的MCT，培养至细胞平铺培养板底80%～90%后进行实验。

1.2.2 细胞增殖分析 将1×105个/ml的MCT处理过的HUVECs接种于96孔细胞培养板中，边缘孔用灭菌PBS填充，37℃、5%CO2条件下培养24h后，根据前期预实验，各孔加入终浓度分别为25、50、100、150、200μg/ml的红花注射液，继续培养 48h后，参照CCK-8试剂盒说明书测定细胞在OD570时的吸光值，计算细胞增殖情况，每孔均重复3次并设MCT组为对照。细胞增殖抑制率（%）=（1-处理组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.3 细胞内NO检测 根据参照文献[6] ，实验中设置未加入红花及未加入MCT的细胞为空白对照组。空白对照组，MCT组、红花注射液组加入终浓度为1μmol/L的 NOS激动剂乙酰胆碱（ACh）和NO敏感性荧光材料二乙酰·二氨基荧光素（DAF-2/DA），在室温和37℃各孵育20min。激光共聚焦显微镜测定细胞在490nm和515nm的DAF-2荧光值，DAF-2荧光值的增加与NO浓度呈线性关系。

1.2.4 Western blot检测 CTGF和eNOS收集培养的HUVECs细胞，用预冷1∶1的PBS缓冲液洗涤2次，加入100μl的细胞裂解液以裂解细胞，加热变性后置于4℃保存。BCA法测蛋白浓度，各取50μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，转移蛋白至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭膜2h，加入相应的一抗和二抗，化学发光试剂增强反应、X线片压片、曝光。经发光成像分析系统测光密度值。实验中以β-actin蛋白量作为对照。

1.2.5 荧光定量PCR实验 搜索Primer Bank，筛选HUVECs细胞适用的CTGF和eNOS荧光定量PCR引物（表1）。引物由上海Invitrogen公司合成。用酚/氯仿法提取以100μg/ml红花注射液和（或）MCT处理的各细胞总RNA；以1μg的RNA为模版，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成 cDNA（37℃ 15min；85℃ 5s）；按照 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）试剂盒说明，以合成的cDNA为模板用480Ⅱ荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR。反应条件为：变性95℃30s，1 个循环，PCR 反应（95℃ 5s，60℃ 30s，40 个循环），熔解（95℃ 5s，60℃ 1 min，95℃，1个循环），降温（40℃ 30s，1个循环）；实验中以β-actin作为对照。反应完成后比对扩增曲线和熔解曲线，用2-ΔΔCt法计算RQ值。

表1 引物序列

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示；组间比较采用ANOVA分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同红花注射液浓度对HUVECs增殖的影响见图1。

图1 红花注射液抑制MCT诱导的HUVECs增殖

由图1可见，随着红花注射液浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用也越强（半数抑制浓度IC50为100μg/ml），红花注射液对HUVECs细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性。

2.2 各组HUVECs NO生成的DAF-2荧光值比较见表2。

表2 各组HUVECs NO生成的DAF-2荧光值比较

由表2可见，空白对照组在ACh处理后DAF-2荧光值明显增加，MCT组DAF-2的荧光值明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而红花注射液组的荧光值与空白对照组类似，亦增加明显，显著高于MCT组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2.33组HUVECs eNOS和CTFG mRNA表达比较见图2。

图2 3组HUVECs eNOS和CTFG mRNA表达比较

由图2可见，与空白对照组比较，MCT组HUVECs的eNOSmRNA表达水平降低，而CTFG mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。与MCT组比较，红花注射液组eNOSmRNA表达水平升高，CTFGmRNA表达水平降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 各组HUVECs eNOS和CTGF蛋白表达比较见图3。

图3 各组HUVECs eNOS和CTGF蛋白表达比较

由图3可见，MCT组HUVECs eNOS蛋白表达水平下调，CTGF蛋白表达水平上调，而红花注射液组eNOS蛋白表达水平上调，CTGF蛋白表达水平下调。

3 讨论

PAH是极难治愈的低存活率疾病[7]，目前在PAH的研究中，多采用MCT处理的方法获得病理模型[8]。MCT可以与血管内皮细胞NDA形成交联，抑制细胞增殖，导致炎性介质如内皮细胞乳酸脱氢酶和前列腺素等的释放增加，血管渗出、水肿及形成血栓，从而导致PAH[9]。

红花是我们国家的传统中药，具有活血化瘀消炎及防止血栓形成、扩张血管、调节心律等作用[10-12]，阐明红花调节血管内皮细胞增殖及抗炎作用的分子生物学机制，可为指导临床用药提供理论依据。PAH是慢性阻塞性肺部疾病发展为心脏病的重要环节，虽然发病机制尚未完全阐明，但目前已有研究表明内皮细胞损伤是PAH的起始环节，内皮功能损伤引起肺血管过度收缩、肺动脉平滑肌细胞过度的分裂增殖，进一步导致血管收缩和血管舒张的生理平衡改变[4-5]。可见，保护肺血管内皮细胞功能可有利于治疗PAH。有研究提示肺动脉内皮细胞是肌化的可能来源细胞，因此适当抑制其在PAH患者中内皮细胞的增殖水平，对其肺血管重构有积极意义。本研究进行了红花注射液抑制人肺动脉内皮细胞增殖的实验，结果显示随着红花注射液浓度的升高，对细胞增殖的抑制作用也越强（IC50为 100μg/ml），并且呈浓度依赖效应，但红花注射液浓度过高造成贴壁细胞的大量脱落。上述试验结果表明红花注射液可抑制人肺动脉内皮细胞的增殖。

NO是重要的血管舒张因子，对血压的调节具有重要作用[13]。MCT可抑制细胞中NO的产生，从而使肺动脉收缩，加速PAH的形成。本试验中，以MCT处理HUVECs，证明MCT可抑制NOS激动剂ACh导致的NO生成，而红花注射液可以将该抑制作用降低，从而使NO的生成基本达到正常细胞水平。Western blot结果显示，红花注射液可减少野百合碱诱导的HUVECs中NOS蛋白表达降低程度，即红花注射液可改善MCT对NOS基因转录及翻译过程的抑制，并提高NOS mRNA的稳定性，使NO合成增加，进而通过NO的增加抑制了细胞的有丝分裂和细胞增生。

有研究表明，在MCT诱导的大鼠PAH模型中，CTGF是组织纤维化过程中的重要分子，CTGF在肺组织中mRNA转录水平升高[14]，而高水平的CTGF导致Ⅰ型胶原蛋白及纤维连接蛋白的大量沉积，最终导致动脉平滑肌细胞或内皮细胞的重排[15]。本试验亦证明MCT可诱导HUVECs表达大量的CTGF，而在红花注射液的作用下，CTGF的高表达可被抑制。但具体的作用机制还需要进一步,深入研究。笔者认为红花注射液可能通过改善动脉内膜的结构重构，减少炎症的发生，扩张动脉，从而改善PAH患者的预后并降低病死率。