全二维气相色谱技术在酒类挥发性化学成分检测中的应用

肖 雪，陈啸天，钱沉鱼，向章敏*

（广东省测试分析研究所 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070）

酒的品质通常受风味类型、原料来源、生产工艺等因素的影响。为了赚取更高的利润，掺假和冒名是酒行业长期以来较为关注的问题[1-2]，因此，酒的品质评价显得尤其重要，其中酒的挥发性化学物质是评价酒品质的最重要的因素之一，通常包括小分子的烃、醇、酯、羧酸、酮、醛以及含氮和硫的化合物[3]。目前已经有大量致力于酒风味挥发性化学成分检测技术的研究，如气相色谱-吸闻器（gas chroma-tography-olfactometry，GC-O）[4-7]、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）或者气相色谱-氢火焰离子化检测器联用（gas chromatographyflame ionization detector，GC-FID）[8-13]等。然而，之前的研究表明酒是一种复杂的基质，并且在一维气相色谱（one-dimensional gas chromatography，1D-GC）分析中常发生许多的共流出峰，导致检测结果出现“假阳性”的现象，因此，具有更高分离能力的技术仍然有待研究。

全二维气相色谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC）在复杂化合物的色谱分离中具有较多优势[14-21]。如图1所示，它提供了一个真正的正交分离系统，把分离机理不同而又互相独立的两支色谱柱以串联方式结合组成二维气相色谱。在这两支色谱柱之间装有的一个调制器起捕集再传送的作用[22]。经第一支色谱柱分离后的每一个馏分，都需先进入调制器，进行聚焦后再以脉冲方式送到第二支色谱柱中进行进一步的分离，所有组分从第二支色谱柱进入检测器。信号经数据处理系统处理后，得到以第一支柱上的保留时间为第一横坐标，第二支柱上的保留时间为第二横坐标，信号强度为纵坐标的三维色谱图，或二维轮廓图[23]。由于在这个过程中，样品经两次完全独立的分离，并在第一次分离运行的时间中完成二维分离，而不是简单的中心切割技术，因此大大提高了对基质干扰背景中目标分析物的分离效果，并且能够在较短的分析时间内提供相当多的样品成分信息[18]。到目前为止，GC×GC已广泛应用于分析石油、农药、大气污染物和环境污染物、精油、食品和药物等领域，并将随着该技术的不断发展而扩展到更多的领域，同时与适宜的风味物质提取方法相结合，如顶空分析技术、固相微萃取技术、同时蒸馏萃取法、溶剂辅助风味蒸发系统和超临界CO2流体萃取法等，对香气组型分离及指纹识别[19]、目标挥发性化合物分析[20]和鉴定未知物[14]方面具有更大的发展前景。最近，周茜等[24]也概述了国内外GC×GC在酒类领域的发展现状及研究动态。而本文主要综述了全二维气相色谱技术在中国白酒、葡萄酒、啤酒等酒中的应用，旨在为其他酒类风味化学物质检测提供参考。

图1 全二维气相色谱的工作原理及特点Fig.1 Working principle and characteristics of comprehensive two-dimensional gas chromatography

1 在中国白酒中的应用

中国白酒是世界上最古老的酒种之一，其通常是高粱、小麦、大米、玉米等谷物发酵后精馏而成，再将新鲜的馏分通过一段时间陈酿，以获得稳定的芳香风味[4]。ZHU S等[25]利用全二维气相色谱技术分析了茅台酒中的风味化学成分，与一维气相色谱相比，GC×GC显示了明显的分析优势，能够检测出茅台酒中528个组分，包括有机酸、醇、酯、酮、醛、缩醛、内酯、含氮和含硫化合物。另外，YAO F等[26]先通过液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）对样品进行预处理，然后用全二维气相色谱-飞行时间-质谱（two-dimensional gas chromatography/time of flight-mass spectrometry，GC×GCTOF-MS）鉴定了泸州老窖酒的风味成分，在18种浓香型老窖酒中检测到了1 300多种化合物，其中320个化合物是每一种酒都有的，另一些则具有各自的特征成分。该研究还发现了24种具有生物活性的化合物，并且有数百种化合物被确定可能是泸州老窖酒特殊风味的来源。

顶空固相微萃取（headspace-solidphase microextraction，HS-SPME）与全二维气相飞行时间质谱相结合的方法常被用来分析白酒的挥发性风味化学成分。李俊等[27]采用此方法对白酒中62种主要挥发性风味成分进行分析，并对不同轮次的贵州传统工艺酱香型白酒进行了检测分析，发现不同轮次酒的挥发性风味物质差异明显，从而为酱香型白酒勾兑和酒品质评价提供了物质基础和方法参考。同时，用该方法阐明了古井贡酒的风味特征，可鉴定出包含醇类、酸类、酯类、醛酮类以及健康功能成分在内的挥发性风味成分800多种，并表明在这些物质的共同作用下，赋予了古井贡酒集风味、口感、健康于一体的完美品质[28]。陈双等[29]采用此方法在景芝芝麻香型白酒中检测到1 029个色谱峰，进一步采用多级鉴定策略确认了可信度较高的挥发性化合物340种，其中在芝麻香型白酒中鉴定出的挥发性组分主要包括酯类130种，醇类26种，有机酸类15种，醛、酮、缩醛类88种，含氮化合物16种，呋喃类20种，含硫化合物25种，萜烯类14种，其他类6种，并首次鉴定了挥发性含硫化合物11种和萜烯类化合物12种。多种挥发性含硫化合物香气独特，香气阈值极低可能对芝麻香型白酒香气特征具有重要贡献。芝麻香型白酒中鉴定出的萜烯类化合物除了具有独特的香气特征外，还具有重要的生理活性。此外，搅拌吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）[30-31]和LLE[32-35]分别与GC×GC-TOF-MS相结合的技术在白酒分析方面也有诸多报道。所以，全二维气相色谱技术可与其他多种分析技术联合，用于中国白酒的酿造及其特征挥发性化学成分的解析具有重要意义。

2 在葡萄酒中的应用

香气是决定葡萄酒品质的重要因素之一，挥发性的甲氧基吡嗪是葡萄酒香气中的重要成分。RYAN D等[36]通过HS-SPME结合氮磷检测器（nitrogen phosphorus detection，NPD）和GC×GC-TOF-MS从葡萄酒中检测到了甲氧基吡嗪，并比较了两者检测2-异丁基-3-甲氧基吡嗪（2-methoxy-3-（2-methylpropyl）pyrazine，IBMP）的能力，结果使用GC×GC-NPD对IBMP的检测限能达到0.5 ng/L，比使用GC×GCTOF-MS的检测限（1.95ng/L）低，但两种方法都能精确而灵敏地对葡萄酒中IBMP含量进行检测。此外，参照同样的方法也被单独用来表征葡萄酒中的香气[37]，利用全二维气相色谱法的检测结果表明，在5℃储存6个月的葡萄酒中没有风味化学成分的显著变化，而储存在15℃和25℃的样品中可检测出芳樟醇、β-大马烯酮、己酸乙酯和辛酸乙酯的含量显著降低。NICOLLIK P等[38]首次通过GC×GC-TOF-MS、定量描述分析（quantitativedescriptiveanalysis，QDA）、GC-FID、GC/MS和GC-O评估了不同葡萄藤管理方式对葡萄酒挥发性成分特征的影响，采用GC×GC-TOF-MS可鉴定220种化合物，包括26种芳香活性化合物，这些物质同时也可被GC-O鉴定。其中，8种挥发性物质对于区分不同品质葡萄酒非常重要，而这8种化合物中有5种只能在第二维柱中分离后才能被检出，并且有3种含量较高的物质可以解释葡萄酒品质与颜色和果实之间的关系。HS-SPME结合GC×GC-TOFMS也可以对葡萄酒不同的葡萄品种（赤霞珠，梅洛，霞多丽，长相思和黑比诺）中的挥发性成分进行色谱分析[39]，检测结果经过多元统计分析发现，可根据葡萄品种中12种挥发性化合物对葡萄酒进行区别和分类。Pinotage葡萄酒作为南非葡萄酒品种的一部分，WELDEGERGISBT等[40]使用GC×GC-TOF-MS鉴定了该品种9种影响酒香气的新型挥发性化学成分，通过对比，发现这9种成分是Pinotage葡萄酒独特的挥发性成分，这项研究结果表明了该品种葡萄酒迄今为止报道的挥发性化学成分的最详细特征。此外，GC×GC也被用于检测Merlot葡萄酒香气的复杂性，因为这种技术具有优于1D-GC的性能[41]。因此，采用全二维气相色谱技术可获得葡萄酒详细的挥发性化学成分信息，为评价葡萄酒品质及寻找特征成分提供便利的分析方法。

3 在啤酒中的应用

近年来，啤酒的销量逐年增长，深受广大消费者的普遍欢迎，因此，各种不同风味的啤酒产品遍地开花。STEFANUTO P H等[42]采用热解吸（thermal desorption，TD）结合GC×GC-TOF-MS对Trappist和craft啤酒的高复杂挥发性有机化合物进行了分析，将HS-SPME、多种搅拌棒吸附萃取（multiple stir bar sorptive extraction，mSBSE）、静态顶空（static headspace，SHS）和动态顶空（dynamic headspace，DHS）多种方法应用于21种具有代表性的啤酒香味化合物的提取，并进行了比较，最终选择了全自动化的DHS进行实验。MARTINS C等[43]通过优化SPME条件对啤酒进行预处理，使用GC×GC对复杂成分进行分离，其中有800个挥发性化学成分被检测到，并对6种商业啤酒进行了检测，确定了32种化合物对啤酒香气有潜在影响。啤酒中的啤酒花香气特征对啤酒的质量非常重要，INUIT等[44]采用GC×GCTOF-MS研究比较了不同的啤酒花品种的香气特征和啤酒中所含化合物的差异，仅关注啤酒花衍生化合物，67种化合物与一个或多个感官描述符密切相关，每种关键化合物的气味描述与每个感官描述符很好地对应，这些化合物很可能是解释啤酒中啤酒花香气特征差异的关键化合物。而粟学俐[45]采用经典的一维气相色谱方法（SPME-GC-MS）技术对啤酒进行风味成分分析，能得到几十种构成啤酒风味的“骨架”成分和相应的指纹谱图，并采用全二维气相色谱/质谱联用技术（GC×GC-MS）对啤酒风味成分进行更高层次的检测，能检测到除一维色谱之外的数百种风味物质。因此，将全二维气相色谱技术用于啤酒挥发性化学物质的检测和辅助质量控制，进一步拓展了新技术新方法在生产实际中的应用前景。

4 其他酒类

众所周知，除白酒、葡萄酒、啤酒是畅销的三大酒外，同时还包含具有一定特色风格的不同类型酒品，如日本清酒中的脂肪气味和苦味具有很明显的特征，经检测发现中链脂肪酸（medium-chain fatty acids，MCFA）和乙基酯能够影响这些风格特征，同时GC×GC-FID被用来定量检测清酒中的MCFA和乙基酯含量，发现已酸浓度与脂肪气味密切相关（P＜0.0001），然后使用GC×GC-TOF-MS确定了与脂肪气味和苦味相关的其他化合物，通过对某些化合物和感官值进行相关分析统计选择后，确定了几个与清酒中的脂肪气味和苦味相关的潜在化合物，如长链烷烃，一些MCFA相关化合物和一些吲哚相关化合物与脂肪气味正相关，而呋喃和酮类化合物与苦味呈正相关[46]。

酒类生产的不同发酵工艺对酒的品质具有重要影响，CARDEAL Z L等[47]就通过GC×GC-TOF-MS研究了在发酵过程中和在不同木材中老化后的朗姆酒品质的差异，通过这种方式，很容易发现在所研究的不同工艺处理的酒之间差别最大的化合物种类，并鉴定出在蒸馏过程中的每个阶段所具有的独特化合物。此外，该作者后续又使用纵向调制低温系统（longitudinal modulated cryogenic system，LMCS）装置的GC×GC-TOF-MS对不同的烈酒样品进行香气分析[48]，采用SPME法提取巴西朗姆酒中的挥发性成分，同时还包括了杜松子酒、伏特加酒、威士忌、龙舌兰酒和加味利口酒。在这个研究中，选择了BPX5作为第一维主色谱柱和BP20第二维色谱柱的组合方式，共检测不同朗姆酒样品中超过200种化合物，其中能够识别的有95种化合物。FRANITZA L等[49]通过溶剂辅助风味蒸馏（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）从25种用甘蔗汁制造的高价朗姆酒和由甘蔗糖蜜制造的26种高价朗姆酒中分离出大量挥发物，然后用GC×GC-TOF-MS分析这些组分，并进行了“综合模板匹配指纹识别”分析，用于提取各组挥发物中存在的整个特征化合物。特征指纹识别有助于甘蔗汁朗姆酒100%的正确分类，因此实现了为更高质量的朗姆酒定位标记的首要目标。进行预处理的特征判别以表征12种重要标记化合物（1-癸醇，γ-十二内酯，3-乙基甲基丁酸酯，壬酸乙酯，3-呋喃甲醛，1-己醇，β-紫罗兰酮，2-和3-甲基丁醇，癸酸甲酯，3-辛醇和2-十一烷酮）。此外，从发酵的山梨中蒸馏而来的Slovak-Czech酒因其独特的香气和口感而受到人们喜爱。VYVIURSKA O等[50]通过HS-SPME和LLE对其进行预处理，然后采用GC×GC-TOF-MS分析检测，探究了两组不同类型的组合柱（非极性×中等极性柱和极性×中等极性柱）的全二维气相色谱分析方法，结果表明超过500种化合物被检测到，近100种与标准相符合。水果酒是近年来发展比较迅速的一种特殊酒类，具有较好的发展前景。CAPOBIANGO M等[51]首次使用多维气相色谱法（multidimensional gas chro-matography，MD-GC）和GC×GC与FID、MS和嗅觉测定法联用的技术，测得了影响香蕉酒香气的主要挥发性化合物是3-甲基丁-1-醇、3-甲基丁-1-醇乙酸酯、2-苯乙基乙酸盐和苯乙醇，该研究将有助于进一步研究不同类型水果酒中的特征化合物。因此，对于新型酒类的挥发性化学成分的检测与分析，全二维气相色谱技术均体现了较好的分析效果，对于促进新型酒业的健康发展提供必要的检测手段和物质基础。

5 展望

全二维气相色谱实现了把分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱以正交方式相组合，使其具有分辨率高、峰容量大、灵敏度高、分析速度快、族分离等特点，已成为一种对复杂样品非常适用的分析技术。近些年，由于不同类型的调制器的改进，GC×GC更加引起了人们的关注。本文阐述了GC×GC-TOF-MS具有表征几种典型酒中挥发性化学成分的分析能力。与传统的1D-GC分离技术相比，GC×GC通常能获得更多数量的色谱峰，有助于分析物之间的分离和减少复杂基质化合物的干扰而导致这些化合物在1D-GC中共洗脱而被错误识别的情况。另一方面，样品预处理与检测仪器的完美结合是分析测试技术未来的发展方向。在酒类挥发成分和香气特征表征方面，顶空采样模式如静态顶空、动态顶空和高浓度容量顶空技术，可便捷地与GC×GC分析仪器在线结合。GC×GC具有鉴别痕量香味活性化合物的能力，将有助于酒品质评价、产品定位、掺假鉴别、工艺控制等方面的应用。除此之外，全二维气相色谱还可以在环境[52]、烟草[53]、石油[54]等领域发挥更大的作用。随着调制器与检测器领域的快速发展，全二维气相色谱技术的应用也将越来越广泛，成为分析领域不可或缺的一部分。