黄芩素对肥胖小鼠体脂及胰岛素抵抗的作用研究

陈美珍，陈简庆，吴红莲

（恩平市人民医院内分泌科，广东恩平 529400）

随着社会生活水平的提高，生活方式的改变，老龄人口增加等，腹型肥胖人群越来越多。现大量有关代谢综合征的研究均提示腹型肥胖和胰岛素抵抗是其发生、发展过程中的两个起最大突出作用的危险因素。肥胖时，机体脂肪增多，而又以内脏脂肪增加更为显著[1-2]。在肥胖患者，体内脂肪的蓄积导致大量非酯化游离脂肪酸（nonesterified fatty acids）大量释放，进入血循环后，可作用胰岛素靶器官（肝脏、脂肪组织、骨骼肌），导致胰岛素抵抗形成。脂肪组织不仅是能量储存库，而且更是一个具有旁分泌、自分泌功能的内分泌器官。它可以分泌大量前炎症因子和脂源性的细胞因子（如脂联素）参与胰岛素抵抗形成和糖耐量异常的发生过程。但是，代谢综合征定义尚未一致，同时其病情复杂，发病机理不明确，深入研究发病机制，可为临床防治提供有益参考。近年来发现天然化合物具有多种药理作用，远较单一化合物作用广泛，因此对天然化合物的开发和研究成为热点，尤其是天然化合物在心血管领域的研究更为火热。有关药物研究显示，黄芩素是黄酮类的化合物，是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取的主要有效成份之一，具有如抗炎、清除氧自由基和保护心脑血管等多种药理作用[3-4]。本实验研究采用高脂饲料诱导C57BL/6 小鼠29 周，建立代谢综合征疾病模型。从个体体重，肝脏、内脏脂肪重量增加等方面评价小鼠肥胖状态；用糖耐量实验、胰岛素耐量实验来评价小鼠机体组织糖耐量降低，胰岛素敏感性下降改变；检测血脂评价小鼠脂代谢紊乱；病理组织形态学显示小鼠肝脏脂肪空泡变性等方面揭示代谢综合征疾病特征。同时从饲料中添加天然化合物黄芩素进行干预对比研究，观察并分析黄芩素对代谢综合征的可能保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物：9 周龄，C57BL/6 小鼠的雄性小鼠120只，购自广东医学院实验动物研究所动物中心。所有实验小鼠饲养于广东医学院SPF 级动物房。温度24±2 ℃，湿度40%～70%，每12 h交替照明,自由饮水进食。

动物饲料主要成分：AIN-76A 标准饲料（脂肪5.2，蛋白质17.7，碳水化合物64.9）；PAIGEN 高脂饲料（脂肪15.8%，胆固醇1.25%，胆酸钠0.5%，玉米油1%）；AIN-76A 标准饲料添加中药黄芩素，药物浓度为0.5；PAIGEN 高脂饲料添加中药黄芩素，药物浓度为0.5。所有饲料均由中国医学科学院实验动物研究所动物中心合成，经钴60 照射处理，密封后冰箱保存。

实验所需药物及试剂：黄芩素粉剂（上海融禾医药科技发展有限公司）；柠檬酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；中性胰岛素注射液（400 IU/10mL/支）（丹麦诺和诺德公司）；10%医用葡萄糖注射液（上海百特医疗用品有限公司）；0.9%氯化钠注射液（武汉滨湖双鹤药业有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

实验动物分组：10 周龄,雄性C57BL/6 小鼠,共120只。采用高脂饲料诱导，建立C57BL/6 小鼠代谢综合征模型。并给予中药黄芩素干预，进行对比观察和研究。实验动物具体分组如下：HFD 组(high fat diet group),给予PAIGEN 高脂饲料；HFD+0.5%Bacalein 组，给予已添加0.5%黄芩素的PAIGEN 高脂饲料饲养；NC 组（normal rodent chow group），用AIN-76A 标准饲料饲养；NC+0.5%Bacalein 组，给予已添加0.5% 黄芩素的AIN-76A 标准饲料饲养。以上各组C57BL/6 小鼠均为30只。

动物饲养及终点取材：C57BL/6 小鼠于室温24±2 ℃,湿度40%～70%喂养，自由饮水摄食。所有小鼠先普通饲料适应性饲养l 周，从小鼠第十周龄开始，按实验动物分组开始正规投食，每周一次称量小鼠食量；在实验开始6 周内，每周均测量记录小鼠体重，以后每两周称量一次小鼠体重，直至小鼠喂养至29 周。在实验第23、24 周，小鼠禁食6 h后，分别行小鼠腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）、腹腔注射胰岛素耐量试验（IPITT)，评价小鼠胰岛素抵抗。第29 周末小鼠在禁食8 h后，先称量体重，采用无水乙醚吸入法麻醉小鼠，Fisher 毛细玻璃采血管经眼眶后静脉丛刺入，采血约1.2 mL 室温下静置1～2 h，使血液自然凝固。4 ℃高速离心机离心分离血清，一部分血清送本院检验科检测血脂。在采血完毕后迅速颈椎脱臼法处死小鼠，快速分离出小鼠全部肝脏，PBS 溶液漂洗血液，用无菌纱布蘸干肝脏表面的液体后置于天平上称量肝脏重量。同时按肝脏重量（g）/小鼠体重（g）×100，计算出肝脏指数。将肝组织在10%福尔马林溶液中固定24 h，逐级脱水，石蜡包埋制成5 μm 切片，行HE 染色，以观察肝脏脂肪病变情况。仔细完全分离出肠系膜、双侧肾周围及双侧睾丸附近的白色脂肪组织，置于天平上称量白色脂肪组织重量。同时按白色脂肪组织重量（g）/小鼠体重（g）×100，计算出脂肪指数。

1.3 数据统计学处理

采用SPSS16.0 统计软件进行数据统计处理,计量资料以均数±标准差（±s）表示,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高脂饲料饲养组小鼠肥胖状态及血脂紊乱

2.1.1 小鼠体重动态变化

从实验第5 周开始，与HFD 组比较，HFD＋0.5% Bacalein 组小鼠体重轻，差异有统计学意义（P＜0.05）；且一直保持至实验终末，未添加药物的高脂饲料饲养小鼠明显肥胖，见图1。

图1 小鼠体重动态变化

2.1.2 小鼠腹围、Lee’s 指数比较

各组小鼠腹围比较差异无统计学意义，说明外周脂肪的增长并不与代谢综合征成平行相关。而小鼠Lee’s 指数比较，反映了HFD 组小鼠较为显著的肥胖状态，见表1。

表1 小鼠腹围、Lee’s 指数比较

2.1.3 小鼠肝脏指数、内脏脂肪指数比较

黄芩素可以降低高脂引起的肝脏重量增加，表现了良好的肝脏保护作用，黄芩素显著降低内脏脂肪，减轻肥胖症状，见表2。

表2 小鼠肝脏指数、内脏脂肪指数比较（%）

2.1.4 小鼠血脂检测

从血脂检测结果来看，黄芩素可以有效降低血总胆固醇和低密度脂蛋白浓度（P＜0.01），见表3。

表3 小鼠血脂（TC、LDL-C）检测（mmol/l）

2.2 高脂饲料饲养组小鼠糖耐量调节受损和胰岛素抵抗

2.2.1 空腹血糖（Fasting Blood Glucose,FBG）

空腹血糖检测比较发现，HFD 组小鼠血糖水平与HFD＋0.5% Bacalein 组小鼠血糖水平无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 四组小鼠空腹血糖比较

2.2.2 小鼠腹腔注射葡萄糖耐量试验（Intraperitoneal injection of glucose tolerance test，IPGTT)

与HFD 组小鼠比较，HFD＋0.5%Bacalein 组小鼠在加入黄芩素干预后可以明显改善由长期高脂饮食引起的胰岛素抵抗状态，增强其糖耐量能力，曲线下面积（AUC）降低15.36%（P＜0.001），见表5。

表5 四组小鼠IPGTT曲线下面积（AUC）比较（mmol.min/l）

2.2.3 小鼠腹腔注射胰岛素耐量试验（Intraperitoneal injection of insulin tolerance test，IPITT)

HFD 组与HFD＋0.5%Bacalein 组相比较，前组小鼠对外源胰岛素的敏感性明显降低，但加入黄芩素干预后可以明显改善由长期高脂饮食引起的胰岛素抵抗状态，增加对胰岛素的敏感性，其曲线下面积（AUC）降低31.6%（P＜0.001），见表6。

表6 四组小鼠IPGTT 曲线下面积（AUC）比较

2.3 HE 染色显示模型组小鼠肝脏组织脂肪变性

HFD 组小鼠肝脏HE 染色显示，肝细胞脂肪脂滴浸润，发生明显的空泡化，脂滴空泡融合成片状，细胞核破坏成散碎片状，着色浅。根据肝脏脂肪病变判断标准，评估HFD 组小鼠的肝脏脂肪变性等级为3 级，约55%～60%的肝细胞发生了明显脂肪变性。高脂饮食组小鼠的肝脏脂肪空泡变较HFD＋0.5%Bacalein 组小鼠肝脏变化非常明显，后组小鼠肝脏细胞形态完好，仅少量细胞有脂肪变性，胞核完整，染色较深，这充分说明了黄芩素在保护肝细胞免受脂肪毒害有重要作用。而NC 组及NC+0.5%Bacalein 组之间比较无明显异常，也充分说明了黄芩素药物本身对小鼠肝脏是没有毒性作用的。

3 讨论

代谢综合征是一种表现复杂的临床综合征，主要包括胰岛素抵抗、腹型肥胖（或称中心型肥胖、内脏型肥胖）、血脂异常、高血压、非酒精性脂肪肝病等。本研究认识到在所有相关危险因素中，异常肥胖（尤其是腹型肥胖）、胰岛素抵抗是与代谢综合征发生发展有关的、两个主要的危险因素。现代社会物质生活水平的提高、生产工作方式极度转变，肥胖人群数量剧增，再加上老龄人群的不断扩大，同时，流行病学显示代谢综合征患者的心血管疾病、2 型糖尿病的发生率分别是正常人的2 倍，5倍[5]，可见其防治愈显关键。但由于其病情复杂，发病机制在当前研究尚未明确，因此深入研究十分必要。本实验动物疾病模型是完全采用长期高脂饲养诱导下建立的，其疾病形成类似人类在自然状态下发生。结果显示，实验小鼠在喂养29 周后，高脂饲料饲养组小鼠肥胖状态非常明显，其终末体重为（40.95±1.03）g,内脏脂肪重量（3.26±0.26）g，而高脂饲料添加黄芩素饲养组小鼠，其终末体重为（35.87±0.93）g,内脏脂肪重量（1.94±0.17）g。两组小鼠终末体重，内脏脂肪重量比较差异非常显著（P＜0.01）。说明了黄芩素有效对抗高脂饮食引起的肥胖，减少内脏脂肪形成。

图2 各组小鼠第26 周肝脏行染色后的病变变化情况(HE×200)

许多临床和研究证据证实[6-7]，腹部脂肪堆积、增多导致各种代谢异常，如糖耐量异常、高血脂。同时，腹型肥胖和胰岛素抵抗与高血压、2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝（NAFLD）发生密切相关。因此有人指出，腹型肥胖是代谢综合征的重要起始因子。

小鼠在长期高脂饮食的诱导下是否发生糖耐量异常和胰岛素抵抗，本实验行糖耐量和胰岛素耐量实验进一步证实和评估。空腹血糖比较，HFD 组小鼠血糖水平低于HFD＋0.5% Bacalein 组小鼠（P＜0.05）。推测与禁食时间较长（6 h），由于HFD＋0.5%Bacalein 组小鼠肝脏病变较轻，不存在肝脏糖原合成、储备功能障碍。当饥饿时，大量的肝脏糖原可以及时代偿性的大量释放，引起血糖上升，而HFD 组小鼠存在脂肪肝病（在肝脏组织形态学HE染色已得到证实），糖原合成、储备减少所致。IPGTT 及血糖曲线下面积（AUC）结果显示，高脂组小鼠血糖值明显高于其他各组，且血糖峰值在腹腔注射葡萄糖液15 min 后出现，在实验第120 min，标准饮食组及加黄芩素干预组小鼠血糖均已降低至空腹前水平，但此时高脂饮食组小鼠由于明显的血糖耐量受损而血糖值下降延迟,加黄芩素干预的高脂饮食组小鼠血糖曲线下面积（AUC）降低15.36%(P＜0.001)，可见，黄芩素有效调节血糖代谢，明显改善糖耐量。IPITT 结果与糖耐量实验结果相对应，高脂饮食组及加黄芩素干预组小鼠血糖值也均高于标准饮食组及加黄芩素干预组，前两组小鼠血糖曲线谷值处在30 min时，在实验2 h后，两组小鼠血糖值均高于空腹基础血糖水平，表明均存在胰岛素抵抗。但高脂饮食加黄芩素干预组血糖值，血糖曲线下面积均低于单纯高脂饲养组(P＜0.001)，充分说明小鼠糖耐量调节受损存在，胰岛素抵抗明显。说明黄芩素也较好地改善了胰岛素抵抗。

在高脂饮食或肥胖时，胞外信号和胞内刺激如氧化应激[8]，内质网应激等均可以激活IKKβ/NF-kB信号通路，促进炎症因子的产生及释放增加[9]。而炎症因子TNF-α、IL-6 等可通过作用于胰岛素受体底物丝氨酸磷酸化，也就相应的阻止了正常情况下的酪氨酸磷酸化而使胰岛素PI3-K 这条代谢通路受损，促成胰岛素抵抗[10]。此外，大量脂肪组织释放出FFAs 入血，由于高浓度的血清FFAs 可增强葡萄糖6-磷酸酶活性，抑制了肝脏糖原的合成、储备，还可作用于胰岛素代谢通路，影响肝脏葡萄糖内摄，导致输出增加。这在胰岛素的另一靶组织骨骼肌也同样产生胰岛素抵抗[11-12]。

对于黄芩素改善胰岛素抵抗，调节血糖耐量保护作用，这可能与它改善高脂引起的游离脂肪酸、前炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等大量释放，促进具保护性的脂联素合成、分泌，拮抗胰岛素的靶器官胰岛素抵抗有关。黄芩素是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取的主要有效成份之一，具有多种药理作用，如抗炎、清除氧自由基和保护心脑血管等作用[13]。尽管现没有查阅到任何黄芩素在代谢综合征中的抗炎研究，但是在慢性炎症或脑创伤，急性胰腺炎等[14-15]研究中，通过有效降低TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎症因子，均显示了强大的抗炎效应和保护作用。因此，本研究推测黄芩素很有可能是通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎症因子表达发挥改善胰岛素抵抗效应，并调节异常血糖代谢。

高脂或肥胖时，随着大量脂肪组织引起的游离脂肪酸大量释放。在肝脏，游离脂肪酸导致葡萄糖，甘油三酯和VLDL 的分泌增加以及包括HDL-C 减少和LDL 增加在内的脂质，脂蛋白异常。本实验血脂检测结果显示，高脂饲料饲养组小鼠TC,LDL-C水平明显高于高脂饲料饲养加黄芩素组（P＜0.01），提示小鼠血脂紊乱显著。病理形态学观察进一步也证实了血脂检测结果的可靠性，高脂饲料饲养组小鼠肝脏组织HE 染色显示，肝细胞脂肪脂滴浸润，发生明显的空泡化，成片状脂肪空泡，细胞核破坏成散碎片状，着色浅。而加黄芩素的高脂饲料饲养组小鼠肝脏细胞形态完好，仅少量细胞有脂肪变性，胞核完整，染色较深。黄芩素对抗高脂的肝脏毒性作用，推测可能主要与它本身具有抗脂质氧化的能力相关。有研究报道，黄芩素能够抑制大鼠肝脏微粒体，线粒体内的铁依耐的脂质过氧化，能保护磷脂酰胆碱脂质体膜免受脂质氧化损伤。而且进步研究分析提示，黄芩素是脂氧合酶抑制剂，其抗氧化能力主要与A,C 环上的羟基集团的数量和位置有关。此外有研究报道[2]，黄芩素通过下调PDGF-β 受体，可以抑制肝脏星形细胞的激活及增殖，可在非酒精性肝病终末期肝硬化形成过程发挥抗纤维化，保护肝脏作用。

4 结论

本研究用高脂饲料饲养诱导C57BL/6 小鼠，形成典型的腹型肥胖；机体组织糖耐量下降，胰岛素敏感性显著降低，明显的糖、脂代谢紊乱；病理组织形态学提示肝脏发生显著脂肪空泡变性，呈非酒精性脂肪肝病病变等，揭示了代谢综合征的基本特征，同时运用黄芩素进行干预对比研究，对代谢综合征作用显示了较强的保护作用，其保护作用可能就是围绕以下两个方面展开:①黄芩素作用于环氧化酶和抑制炎症信号通路中枢NF-KB 途径，减少炎症因子TNF-α,IL-1β、IL-6 等产生和释放，显示了强大的抗炎效应，也就很好的改善胰岛素抵抗状态，有效减轻肥胖；②黄芩素可以有效清除大量内脏脂肪堆积形成的ROS、自由基及抑制游离脂肪酸释放，调节糖代谢，增强胰岛素靶器官的胰岛素敏感性。