姜黄素激活PPAR-γ及对脑胶质瘤抑制作用研究

段 然

（北京大学国际医院神经外科，北京 102206）

脑胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈现逐年升高的趋势［1］。手术是治疗脑胶质瘤的常用方法，然而由于脑胶质瘤恶性化程度较高、侵袭和浸润能力较强，手术很难切除所有病灶。虽然放、化疗可以有效控制肿瘤的生长，然而由于脑部解剖位置特殊，且有血脑屏障阻碍药物向脑部的分布，因此其疗效较差，患者生存期较短［2-3］。现代研究表明姜黄中的有效成分姜黄素具有良好的抗肿瘤作用，对结肠、肝脏、乳腺等多种肿瘤具有良好的抑制和杀伤作用［4］。本研究探讨姜黄素对人脑胶质肿瘤细胞的体外抑制作用以及其可能的作用机制，以期为新型抑制剂的研发提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

姜黄素购自北京金路鸿生物技术有限公司，使用无水二甲基亚砜（DMSO）溶解，并配制成100mM储备液，贮存于-20°C条件下。DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购Biochrom公司，XTT试剂{c；3，3'-［1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑］-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸钠和吩嗪二甲酯硫酸盐}、碘化丙啶以及PPAR-γ抑制剂GW9662购自Sigma公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒购自浙江浙科仪器设备有限公司。PPAR-γ和基因PCR引物［5］为上游：5'-CTTGGGTCGGCCTCGAG-3'，下游：5'-CATTACGGAGAGATCCACGGA-3'；GADPH基因引物为上游：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，下游：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。引物由上海生工合成。

1.2 细胞培养

胶质瘤细胞系U251细胞株购自ATCC。培养基的选择、传代方法和时间以及培养条件根据按照ATCC网页中的描述进行。培养基为含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素的DMEM培养基。培养箱温度37°C，二氧化碳含量5%。使用0.25%胰酶-EDTA对细胞进行解离。

1.3 细胞活力测试

肿瘤细胞于实验前一天种植于96孔板中，每孔5 000个（2.5×104个/mL，200µL），在37°C，二氧化碳含量5%的培养箱中培养24h后弃去原培养基。对照组和观察组细胞分别培养于含有DMSO（0.1%）不同浓度姜黄素，以及姜黄素与GW9662混合物的DMEM培养基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素），分别培养24h、48h和72h。培养结束后，向各孔中加入XTT试剂，试剂用量以及反应时间按说明书选择。培养约2h后，在450和650nm波长下测定每孔的吸光度A450和A650。细胞活力按照以下公式计算。

细胞活力（%）=处理组A450-处理组A650/（对照组A450-对照组A650）×100%

1.4 细胞周期分析

U251肿瘤细胞于实验前1天种植于24孔板中，每孔300 000个（0.5 x 106个/mL，600µL），培养24h后弃去原培养液。对照组和观察组细胞分别培养于含有DMSO（0.1%）不同浓度姜黄素，以及姜黄素与GW9662混合物的DMEM培养基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素），培养24h、48h和72h。培养结束后，细胞使用0.25%胰酶-EDTA解离，400g条件下离心10min，收集沉淀物。细胞沉淀用70%乙醇（-20°C）固定，并加入PI染色30min。染色结束后用磷酸盐缓冲液清洗2次，并将细胞重悬于300µL磷酸盐缓冲液中，并使用流式细胞仪进行检测。处于不同细胞周期的细胞含量计算由Flowjo完成。

1.5 PPAR-γ基因表达的测定

U251肿瘤细胞于实验前1天种植于24孔板中，每孔300 000个（0.5 x 106个/mL， 600µL），培养24h后弃去原培养液。对照组和观察组细胞分别培养于含有DMSO（0.1%）不同浓度姜黄素，以及姜黄素与GW9662混合物的DMEM培养基中（含有1%胎牛血清和100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素），培养8h。培养结束后细胞用0.25%胰酶-EDTA解离，并用PBS清洗一次。随后使用Trizol法提取总RNA，逆转录成为cDNA。最后加入引物，并使用rt-qPCR对PPAR-γ基因表达进行定量。操作按照试剂盒的说明进行。

1.6 统计学分析

数据使用Microsoft Excel 进行整理，并用SPSS 19.0统计软件处理分析。计量资料以（±s）表示，实验数据来源于至少3次独立重复试验。多个样本的比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行，并用Tukey检验比较各组间差异的显著性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜黄素对U251细胞活力的影响

不同浓度姜黄素对U251细胞活力的影响见表1至表3。结果表明姜黄素对U251细胞活力的影响呈现剂量和时间依赖性。同时，检测了PPAR-γ抑制剂GW9662对U251细胞活力的影响，结果表明GW9662本身对于U251细胞的活力没有影响，给药24、48和72h后U251细胞的活力与对照组相似，差异无统计学意义（P＞0.05）。然而，GW9662 可以显著减弱姜黄素对U251细胞的抑制能力，接受两种药物共同处理的细胞活力较单独使用姜黄素组明显提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 姜黄素和GW9662培养24h对U251细胞活力的影响 （%，±s）

表1 姜黄素和GW9662培养24h对U251细胞活力的影响 （%，±s）

分组 细胞活力 t（与对照组比较）P（与对照组比较）对照组 100.0 0± 0.00姜黄素 1µM 94.04 ± 1.94 3.05 0.373姜黄素 3µM 91.96 ± 1.67 4.12 0.119姜黄素 10µM 87.50 ± 2.60 6.41 0.007姜黄素 30µM 72.64 ± 1.53 14.03 ＜0.001 GW9662 10µM 97.03 ± 0.60 1.52 0.925姜黄素 30µM + GW9662 10µM 83.98 ± 3.26 8.21 ＜0.001

表2 姜黄素和GW9662培养48h对U251细胞活力的影响 （%，±s）

表2 姜黄素和GW9662培养48h对U251细胞活力的影响 （%，±s）

P（与对照组比较）对照组 100.00±0.00姜黄素 1µM 91.11±2.67 4.27 0.100姜黄素 3µM 89.67±2.83 4.96 0.042姜黄素 10µM 80.85±1.94 9.20 ＜0.001姜黄素 30µM 41.74±2.42 29.87 ＜0.001 GW9662 10µM 97.86±1.21 1.03 0.988姜黄素 30µM + GW9662 10µM 75.92±0.64 11.570 ＜0.001分组 细胞活力 t（与对照组比较）

表3 姜黄素和GW9662培养72h对U251细胞活力的影响 （%，±s）

表3 姜黄素和GW9662培养72h对U251细胞活力的影响 （%，±s）

P（与对照组比较）对照组 100.0±0.00姜黄素 1µM 93.27±2.31 3.15 0.339姜黄素 3µM 84.62±2.92 7.21 0.003姜黄素 10µM 74.03±2.04 12.17 ＜0.001姜黄素 30µM 46.14±2.15 25.24 ＜0.001 GW9662 10µM 98.32±1.37 0.78 0.997姜黄素 30µM + GW9662 10µM 63.60±2.71 17.06 ＜0.001分组 细胞活力 t（与对照组比较）

2.2 姜黄素对U251细胞周期分布的影响

姜黄素引起的细胞凋亡和细胞周期分布见表4至表6。结果表明姜黄素可以诱导Sub-G0期细胞的相对含量，且其诱导细胞凋亡的作用呈现时间依赖性。分析细胞周期的分布后，姜黄素主要引起细胞G0/G1期细胞周期阻滞，且作用呈现时间依赖性。在药物作用的24～72h内，PPAR-γ抑制剂GW9662对U251细胞Sub-G0期的含量以及G0/G1期分布没有明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。GW9662可以显著降低姜黄素对U251细胞凋亡的诱导，明显减少位于Sub-G0期细胞的含量（P＜0.05）。同时GW9662可以逆转姜黄素引起的G0/G1期细胞周期阻滞，明显降低G0/G1期细胞的含量，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 姜黄素以及GW9662培养24h对U251细胞周期的影响 （%，±s）

表4 姜黄素以及GW9662培养24h对U251细胞周期的影响 （%，±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05。

分组 Sub-G0 G0/G1 S G2/M对照组 7.19 ± 1.45 34.21 ± 1.54 26.92 ± 3.75 34.33 ± 2.41姜黄素 30µM 25.03 ± 2.62△ 53.73 ± 1.06△ 9.75 ± 2.31△ 38.52 ± 2.23 GW9662 10µM 6.43 ± 1.38 34.37 ± 0.46 29.69 ± 1.28 36.52 ± 2.56姜黄素 30µM +GW9662 10µM14.04 ± 0.81△ 44.12 ± 1.76△ 13.18 ± 0.91△ 35.68 ± 1.17

表5 姜黄素以及GW9662培养48h对U251细胞周期的影响 （%，±s）

表5 姜黄素以及GW9662培养48h对U251细胞周期的影响 （%，±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05。

分组 Sub-G0 G0/G1 S G2/M对照组 4.72 ± 1.08 33.87 ± 1.35 30.9 ± 0.7 32.54 ± 2.08姜黄素 30µM 32.76 ± 2.85△45.73 ± 2.36△6.32 ± 2.63△ 19.61 ± 1.02 GW9662 10µM 7.24 ± 1.25 30.81 ± 1.88 31.57 ± 2.39 31.38 ± 1.58姜黄素 30µM +GW9662 10µM22.93 ± 0.83△42.89 ± 1.8△ 11.17 ± 0.79△35.38 ± 0.71

表6 姜黄素以及GW9662培养72h对U251细胞周期的影响 （%，±s）

表6 姜黄素以及GW9662培养72h对U251细胞周期的影响 （%，±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05。

分组 Sub-G0 G0/G1 S G2/M对照组 4.94 ± 1.46 35.85 ± 1.6 31.44 ± 3.56 37.88 ± 2.74姜黄素 30µM 40.08 ± 2.99△43.65 ± 1.23△9.22 ± 1.92△ 24.62 ± 1.20 GW9662 10µM 4.76 ± 0.17 35.66 ± 1.83 30.84 ± 1.09 36.19 ± 1.99姜黄素 30µM +GW9662 10µM22.78 ± 0.25△ 34.92 ± 1.31 12.96 ± 0.81△ 36.34 ± 1.19

2.3 姜黄素对PPAR-γ基因转录的影响

姜黄素对PPAR-γ基因转录的影响见表7。姜黄素可以提高PPAR-γ基因的表达，并呈现剂量依赖性。低剂量组（10µM）可以提高PPAR-γ基因的转录水平，但差异无统计学意义（P＞0.05）。GW9662对PPAR-γ基因的转录不产生明显影响，但可以显著降低姜黄素引起的PPAR-γ基因转录升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表7 姜黄素对PPAR-γ基因转录的影响 （倍，±s）

表7 姜黄素对PPAR-γ基因转录的影响 （倍，±s）

P（与对照组比较）对照组 1.00±0.00姜黄素 10µM 1.21±0.06 3.500 0.149姜黄素 30µM 1.40±0.08 6.667 0.002 GW9662 10µM 0.99±0.08 0.167 1.000姜黄素 30µM+GW9662 10µM 1.14±0.04 2.333 0.491分组t（与对照组比较）mRNA转录PPAR-γ/GADPH（倍数）

3 讨 论

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）是一类配体激活型核受体，其活性与肿瘤细胞的生长、凋亡以及肿瘤细胞微环境的变化有密切联系。体外研究表明，PPAR-γ受体在包括乳腺癌、肺癌、肠癌、肝癌以及脑胶质细胞瘤的多种肿瘤细胞中均有表达［6-8］；在U251肿瘤细胞中，由于miR-130b高表达等因素的作用，PPAR-γ呈现低表达状态；提高PPAR-γ的表达可以有效降低肿瘤的增殖和生长，加速肿瘤凋亡［9-10］。与提高其表达相似，通过药物激活肿瘤细胞中的PPAR-γ受体也可以有效抑制细胞增殖、从而抑制肿瘤的生长和侵袭。具体机制包括以下几类：激活PPAR-γ可以抑制细胞周期蛋白激酶Cdk4的活性，提高对Cdk4活性具有抑制作用的其他蛋白，例如p19、p21以及p27的表达，影响细胞的分裂过程［11］；其次，激活PPAR-γ可以降低抗凋亡相关蛋白Bcl-2的含量，提高凋亡相关酶类Caspase-3 和 Caspase-7的活化，又到细胞凋亡［12］。此外，激活PPAR-γ可以降低COX-2、VEFG以及炎症因子的表达，抑制肿瘤诱导的血管新生，并诱导细胞分化，从而抑制肿瘤的进展［13］。

姜黄素是莪术的主要有效成分之一，体外研究表明对多种肿瘤细胞有良好的抑制作用。研究结果表明，姜黄素的体外抗肿瘤作用与激活PPAR-γ有关。在姜黄素的作用下，U251细胞中PPAR-γ基因表达明显提高；细胞周期分析表明大多数细胞位于sub-G0期以及G0/G1期，其形成原因可能与姜黄素诱导细胞凋亡以及抑制Cdk4活性有关。上述研究结果与已有的文献报道一致。为了进一步证明其作用靶点位于PPAR-γ，用特异性抑制剂GW9662与姜黄素共同处理细胞，结果表明姜黄素对U251细胞的杀伤作用、诱导细胞凋亡的作用以及提高PPAR-γ表达的作用均明显减弱。以上结果进一步确认PPAR-γ与姜黄素对U251细胞的生长抑制作用有关。值得注意的是，在GW9662存在的条件下，姜黄素依然具有一定的体外抗肿瘤活性，推测其抗肿瘤作用还可能还存在其他机制。根据其化学结构与ATP的相似性，推测其作用靶标可能还包括激酶等，需要进行进一步研究。

综上所述，实验结果表明姜黄素可以提高胶质瘤U251细胞PPAR-γ的转录，诱导细胞凋亡以及G0/G1期细胞周期阻滞，其对肿瘤细胞生长的抑制作用于激活PPAR-γ有关。