菌根共生对铁皮石斛生长发育的影响

王秋霞 胡虹

摘要：以铁皮石斛（Dendrobium officinale）为试材，采用菌根真菌（S1和S3）与铁皮石斛幼苗共培养的方法，研究了菌根共生对铁皮石斛幼苗阶段生长发育的影响。结果表明：共培养前期，菌根真菌（S1和S3）与寄主保持着共生关系;后期，这种共生关系逐渐消失，真菌菌丝大量聚集在根外。菌根真菌在铁皮石斛生长前期促生作用强于生长后期，表明菌根真菌在兰科幼苗生长阶段仍保持着一定的促生作用，但随着共生关系的消解，促生作用也逐渐减弱。

关键词：菌根共生;生长发育;铁皮石斛;菌根真菌

中图分类号：S682.31  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2019）01-0055-06

Effects of Mycorrhizal Symbiosis on Growth and

Development of Dendrobium officinale

Wang Qiuxia Hu Hong 2

（1.Department of Life Sciences and Technology， Kunming University， Kunming  650214， China;

2. Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology， Kunming Institute of Botany，

Chinese Academy of Sciences， Kunming   650201， China）

Abstract Dendrobium officinale was used as experimental materials. Through the co-culture experiment of D. officinale seedlings with mycorrhiza fungi Epulorhiza sp. （S1） or Tulasnella sp. （S3）， the influences of mycorrhizal symbiosis on growth and development of D. officinale seedlings were investigated. The results showed that the mycorrhiza fungi （S1 and S3） kept the symbiotic relationship with their hosts at the earlier stage， and the symbiotic relationship gradually disappeared at the later stage. A large number of hyphae gathered outside the roots. Both S1 and S3 fungi promoted better growth of D. officinale at the earlier stage than at the later stage. In conclusion， the mycorrhizal symbiosis maintained a certain role at the earlier growth stage of Orchidaceae seedlings. However， with the dissolution of symbiotic relationship， the promoting effect was gradually weakened.

Keywords Mycorrhizal symbiosis; Growth and development; Dendrobium officinale; Mycorrhiza fungi

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属多年生附生草本植物，是传统名贵药食两用中药材，因具有滋阴清热、益胃生津、增强免疫力、抗肿瘤、降血压、降血糖、抗氧化和抗衰老等多种功效，被列为“中华九大仙草之首”，素有“药中黄金”之美称。野生铁皮石斛一般生长在海拔 1 600 m 以下的树干、山谷和沟边的半阴湿岩石上，种子微小无胚乳，在自然条件下萌发率极低，且其生境的破坏和过度采挖使野生铁皮石斛资源日趋濒危，已被列入《国家重点保护野生药材物种名录》和《中华人民共和国珍稀濒危植物名录》[1]。

菌根共生在兰科植物的生长和生命活动中具有重要作用，尤其是在兰科种子萌发和原球茎发育阶段[2，3]，与兰科植物息息相关。自然生态条件下，只有感染了合适的真菌后兰科植物种子才能萌发生长[4，5]。但目前有关菌根共生对兰科植物幼苗生长发育阶段的影响研究相对较少。研究表明，一些兰科植物的叶片长出后可以进行光合作用，因而不再需要菌根真菌提供能源物质，说明当宿主植物長到一定阶段后，可以独立于真菌而存在[6];但有些兰科植物在能进行光合作用阶段仍与菌根真菌保持共生关系，这对宿主生长发育会产生怎样的作用尚不明确。本研究通过菌根真菌和铁皮石斛幼苗共培养的方法，探讨菌根共生对铁皮石斛幼苗生长发育的影响，旨在为兰科菌根研究提供理论基础，为铁皮石斛资源利用和人工繁育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛4个月苗龄的无菌苗;菌根真菌Epulorhiza sp. （S1） 和Tulasnella sp. （S3），从野生铁皮石斛根部分离得到。

1.2 共培养试验

1.2.1 共培养 共培养的培养基为1/2MS+ 0.75% 蔗糖+0.75%琼脂[7]。选取铁皮石斛4个月苗龄的无菌苗，在超净工作台上转接入玻璃组培瓶中（容积600 mL，瓶口内径5 cm）的定量（100 mL/瓶）共生培养基中，每瓶8株幼苗。将S1和S3真菌在PDA平板上培养，待菌丝长满平板，备用。接苗前先在电子天平上称量装有培养基的组培瓶重量（精确到0.01 g），接入苗后再称重，计算每瓶的苗重。7 d后，选取无污染的苗，用打孔器（0.33 cm 2）打取PDA平板培养基上活化的S1和S3菌株琼脂块，每瓶接入一个带菌的琼脂小块，置于培养瓶中心的培养基上，使染菌的琼脂块离8株幼苗的距离大致相同;对照组接入无菌琼脂块。每处理25个重复。所有接菌处理苗和对照苗均置于温度（26±1）℃、光照50 μmol·m  -2 ·s  -1 、光周期12 h/d的组培室内培养。

1.2.2 铁皮石斛生长指标的测定 共培养60、120、180、240、360 d时，观察每个处理组和对照组铁皮石斛苗的长势，并拍照。准确称取处理组和对照组苗的重量，结合处理前的重量，计算苗鲜重的增长量。测量株高、茎长、茎粗、节间长，统计新根数、分蘖株数和茎节数。然后将苗置80℃烘箱中48 h，记录苗的干重。以上均以瓶为单位统计。

1.2.3 菌根共生情况的观察 取共培养不同阶段铁皮石斛苗的根观察菌根共生情况。采集样品时，保护好根系，洗去根部附着的培养基，拍照。随机选取各处理苗的健康营养根段，放入无水乙醇中固定24 h以上，取出置10% KOH溶液中过夜，然后转移到染液中浸染60 min。染液组成：10 μg/mL WGA-AF（wheat germ agglutinin-alexa fluor conjugate）488;0.02%吐温20;1×PBS（137 mmol/L NaCl，27 mmol/L KCl，100 mmol/L Na2HPO4， 2 mmol/L K2HPO4， pH 7.4）。在染色过程中，抽真空3次。染色结束后，将样品转移到PBS缓冲液中漂洗3次，再放入20 μg/mL碘化丙啶（PI）染液中染色 3 min，取出后用 PBS 缓冲液漂洗3次[8]，最后将样品放在载玻片上，用激光共聚焦显微镜（OLYMPUS FV1000）进行观察并拍照。WGA-AF 488 激发光为 488 nm 激光，檢测光为 500～540 nm;PI 激发光为 559 nm 激光，检测光为 570～619 nm。

1.3 数据分析

试验数据用SPSS 17.0软件进行分析，不同处理间的差异比较采用单因素方差分析（ANOVA）和LSD检验。用SigmaPlot 10.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 菌根真菌与不同生长阶段铁皮石斛根共生情况

图1显示，对照苗CK的根在共培养期间，结构无大的变化，在共培养360 d时，有少量根毛存在。接菌苗在接菌60 d时根的皮层细胞内发现有菌丝或菌丝团存在，120～180 d时有大量的菌丝定殖于皮层细胞内，根外聚集了大量的菌丝;240 d后，根的皮层细胞内菌丝或菌丝团基本消失，但铁皮石斛的根毛较发达，菌丝缠绕在根毛上。

2.2 菌根共生对铁皮石斛不同阶段生长发育的影响

由图2可见，铁皮石斛所有处理苗均健康生长，接种S1和S3真菌的幼苗均比未接菌苗旺盛，分蘖株明显多于对照。在接种240 d后，S1接菌苗已经有开花现象。而在S3接菌苗和对照苗中未发现开花植株。

由图3可见，铁皮石斛S1接菌苗的鲜重增长量在整个生长过程中都显著高于对照苗，而S3接菌苗的鲜重增长量在生长前期显著高于对照苗（P<0.05），生长后期差异不显著。接菌苗的干重在整个生长过程中显著高于对照苗（P< 0.05）。

由图4和图5可见，接菌苗的茎粗和茎长在生长前期显著高于对照苗（P<0.05），而后期与对照苗无显著差异。接菌苗的节间长在接种60 d和120 d时，与对照苗均有显著差异（P<0.05），180 d时与对照苗无显著差异;但240 d时，S1接菌苗的节间长显著高于对照苗（P<0.05），S3接菌苗与对照苗无显著差异;360 d时接菌苗的节间长又显著高于对照苗的 （P< 0.05）。接菌苗株高在接种后120 d内显著高于对照苗的（P< 0.05）， 180 d后差异不显著。

由图6可见，接菌苗的节间数在接种60～180 d的生长期间显著多于对照苗的（P<0.05），240 d后与对照苗无显著差异。S1接菌苗的分蘖株数在360 d的共生期内显著高于对照苗的（P< 0.05）， S3接菌苗的分蘖株数在接种后180～240 d与对照苗无显著差异。

由图7可见，S1和S3接菌苗的新根数在接种60 d时均显著多于对照苗（P<0.05）;120～180 d的共生期内，S1接菌苗的新根数显著多于对照苗（P<0.05），而S3接菌苗的新根数少于对照苗;240～360 d内，接菌苗与对照苗的新根数无显著差异（P>0.05）。

3 讨论与结论

兰科植物的种子萌发和原球茎生长阶段都必须依靠菌根真菌为其提供营养[8]，但在幼苗生长阶段菌根共生能持续多久尚不清楚;而且成年兰科中菌根共生现象变化较大，所以菌根真菌对兰科不同生长阶段可能会产生不同的作用[9-15]。本研究中，两种菌根真菌（S1和S3）在与铁皮石斛共培养的过程中，随着共培养时间的延长，与寄主的共生关系发生了变化，共培养60～180 d内与铁皮石斛保持着共生关系，240 d后共生结构慢慢消失，表现出共培养前期对寄主的促生作用较大，后期对寄主的促生作用较弱。有些附生兰在成年阶段没有菌根共生现象[16，17]，这可能是因为这些兰科植物在具备光合能力后，光合产物及根部的营养吸收能满足自身生长发育的营养需求，所以就完全脱离了菌根真菌。由此推测，部分兰科植物在成年阶段仍然与菌根真菌保持着共生关系，可能是因为自身尚无法满足生长发育的需求，需要形成菌根共生来提供必需的营养物质。

本研究中，我們还观察到菌根真菌可以诱导铁皮石斛根产生大量根毛，这一现象在兰科已有的研究中尚未见报道;而且，在共培养试验中，接种S1和S3真菌的铁皮石斛幼苗新根数显著高于未接菌苗。研究发现，菌根真菌能诱导铁皮石斛的支根数量增加[18]。菌根植物根毛密度越大，真菌定殖率越高，暗示着菌根真菌对寄主的作用越强;菌根真菌对寄主的作用及在寄主根部的定殖率也受根毛长度和根冠比的影响[19];菌根真菌还可以增加寄主支根分裂程度、侧根的长度与数量，从而增加寄主与生长基质的接触面积，有助于从基质中吸收更多的养分，进而促进寄主的生长[20]。由此可见，S1和S3菌根真菌能促进铁皮石斛幼苗生长发育的原因之一可能是菌根共生使铁皮石斛产生大量的根毛及新根，增加了与生长基质的接触面积，从而促进根部营养物质的吸收和利用。

综上所述，菌根真菌S1和S3与铁皮石斛幼苗形成了共生关系，但随着共培养时间的延长，这种共生关系逐渐消解，共培养240 d后对铁皮石斛幼苗生长发育的影响逐渐减弱。这为兰科植物的菌根研究奠定了一定的理论基础，为铁皮石斛的人工繁育提供了一定的理论依据。

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