戈宝红麻叶片水提物的抗氧化作用

张孟丽， 张卫明， 束成杰*

( 1.南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 210023；2.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211100)

戈宝红麻(ApocynumvenetumL.var.aletaienseH.T.Lau，var.nov.)为多年生草本植物，宿根正常可存活30 a左右，根系发达，具有极强的抗逆性，是美化沙漠、防风固沙、涵养水源、改善局域环境最好的生态植物[1]。戈宝红麻含有黄酮类、糅质、甾体类、有机酸类、氨基酸等活性成分，其具有解郁安神、降血压、降血脂、抗氧化等功效[2-3]。

机体氧化衰老在自然界是不可逆的，其机制复杂。随着人们健康意识的增强，逐渐认识到化学合成抗氧化剂的危害，天然抗氧化剂由于具有天然、高效、低毒的特点逐渐为人们所利用并取代人工合成抗氧化剂。天然抗氧化剂是直接从天然生物中提取的抗氧化剂，对人的副作用和伤害较小，因此国内外对天然抗氧化物质的研究越来越多[4]。秀丽隐杆线虫作为经典模式生物，由于自身结构简单，易于培养，广泛应用于人类遗传学疾病、药物筛选、衰老与寿命、信号传导等各个领域[5-6]。笔者通过体外研究戈宝红麻叶片水提物的抗氧化活性，借助秀丽隐杆线虫通过体内研究其抗衰老作用，以期为戈宝红麻叶片的高值高效利用，开发抗氧化、降低血糖血脂等功能性食品及保健品提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 戈宝红麻叶片、线虫与菌株 戈宝红麻叶片为成熟期戈宝红麻叶片，采自新疆阿勒泰地区；秀丽隐杆线虫为野生型N2，大肠杆菌菌株E.coliOP50(尿嘧啶缺陷型)，均由南京野生植物综合利用研究院提供。

1.1.2 试剂与仪器 试剂：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海麦克林公司)，琼脂、多聚蛋白胨(日本制药株式会社),超氧化物歧化酶测试盒、过氧化氢酶测试盒(南京建成生物工程研究所)，其余试剂均为国产分析纯。仪器：电子分析天平(上海越平科学仪器有限公司),T6紫外/可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂),奥林巴斯显微镜(OlympusBX41，南京艾朗仪器有限公司),涡旋震荡器(上海珂淮仪器有限公司),SPX-150B-Z型生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),BG-50隔水式培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),JW-25017HR高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司),JSZ6系列连续变倍体视显微镜(江南永新光学有限公司),紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司),酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品液制备 将戈宝红麻叶片除杂干燥，粉碎，称取粉末50 g，共2份，加入8倍体积水，80℃回流提取3次，每次1 h，合并提取液，5 000 r/min离心10 min，过滤放至室温，减压回收溶剂，收集滤液；分别将戈宝红麻水提液置于真空冷冻干燥箱中干燥，得叶片水提物固体粉末，复溶。

1.2.2 体外抗氧化试验

1) 清除DPPH自由基。将戈宝红麻水提物配置成1 mg/mL起始浓度备用。再将样品溶液及标准维生素C(VC)依次配置成浓度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL和1 000 μg/mL的溶液，标准VC作阳性对照。用70%乙醇溶液配置成0.1 mmol/L DPPH溶液500 mL，放置于4℃冰箱保存。依次向10 mL试管中加入DPPH溶液4.0 mL、提取物0.2 mL，混匀后置于暗处放置30 min，测吸光度值A1；同时用70%乙醇代替DPPH溶液4.0 mL为样品空白，测吸光度值A2；用70%乙醇溶液0.2 mL代替抗氧化物作空白对照，测吸光度值A0，用蒸馏水做参比，在波长510 nm下比色，最后计算清除率[7-8]。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

2) 清除超氧自由基(O2-·)。将戈宝红麻水提物配置成1 mg/mL起始浓度备用。再将样品溶液及标准VC依次配置成浓度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL，标准VC作阳性对照。分别取50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)4.5 mL于10 mL试管中，放入25℃水浴中预热20 min，分别加入提取液2.0 mL，再加入25 mmol/L邻苯三酚0.4 mL，混合后在25℃水浴条件下反应4 min，后立即加入2滴8 mmol/L HCl终止反映，同时设定空白组和样品空白组，用蒸馏水做参比，在波长320 nm下比色，最后计算清除率[9]。

3) 还原能力。将戈宝红麻水提物配置成1 mg/mL起始浓度备用。再将样品溶液及标准VC依次配置成浓度20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL的溶液，标准VC作阳性对照。分别取各溶液2.0 mL，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液 (pH 6.6) 2.0 mL，再加入1%铁氰化钾溶液2.0 mL，混合后在50℃水浴中反应20 min。取出后在混合物中加入10%三氯乙酸2.0 mL，再分别从中取出2.0 mL混合物，加蒸馏水2.0 mL和0.1%三氯化铁0.4 mL于试管中，用蒸馏水稀释至20 mL，反应10 min后于700 nm处测定吸光度值[10]。

1.2.3 基于秀丽隐杆线虫的体内抗氧化试验

1) 秀丽隐杆线虫生长培养基(NGM)的配制。氯化钠3 g，琼脂粉17 g，多聚蛋白胨2.5 g，加入蒸馏水975 mL，高压灭菌。加入1 mol/L氯化钙1 mL，1 mol/L硫酸镁1 mL，磷酸钾缓冲液25 mL，待冷却至50℃左右时加入5 mg/mL胆固醇1 mL，摇晃混匀后倒入紫外灭菌后的培养皿内[9]。

2) 秀丽隐杆线虫同步化。当秀丽隐杆线虫体内出现大量虫卵时，加入秀丽隐杆线虫裂解液(10%次氯酸∶1 mol/L氢氧化钠=1∶1)，离心，洗涤，放置涂有直径1 cm大肠杆菌E.coliOP50的培养基上，20℃培养48～60 h，得年轻成虫[11]。

3) 秀丽隐杆线虫暴露方法。将同步化后的秀丽隐杆线虫转移到含有大肠杆菌E.coliOP50的新培养基中，对照组加入M9缓冲液，暴露组分别加入浓度为10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL和1 000 μg/mL戈宝红麻叶片水提物，20℃处理24 h，然后进行后续试验。

4) 水提物对秀丽隐杆线虫寿命的影响。随机挑取暴露后的秀丽隐杆线虫至含有大肠杆菌E.coliOP50的培养基上，每组33条，同时设对照组，3次重复，在20℃条件下培养。将秀丽隐杆线虫从培养基上洗下当天起计算存活天数，并每天记录存活和死亡条数，持续至最后1条死亡为止，以铂金丝碰触秀丽隐杆线虫仍然不动即判定为死亡。根据线虫生存、死亡的条数绘制曲线[12-13]。

5) 水提物对秀丽隐杆线虫头部摆动的影响。随机挑取暴露后的秀丽隐杆线虫至含M9缓冲液的空白培养基上，观察其头部摆动频率。观察前先让秀丽隐杆线虫自由摆动恢复1 min，在显微镜下观察并记录1 min内的头部摆动次数，作为头部摆动频率指标，每组观察15条，同时设对照组，3次重复。1次头部摆动定义为其头部摆动方向改变，改变必须转过其身体朝向方向[14]。

6) 水提物对秀丽隐杆线虫吞咽频率的影响。随机挑取15条暴露后的秀丽隐杆线虫至涂有大肠杆菌E.coliOP50的培养基上，同时设对照组，观察其吞咽频率，在奥林巴斯高倍显微镜下观察并记录1 min内秀丽隐杆线虫的吞咽次数，作为吞咽频率指标，3次重复[14]。

7) 水提物对秀丽隐杆线虫排泄周期的影响。随机挑取15条暴露后的秀丽隐杆线虫至涂有大肠杆菌E.coliOP50的培养基上，同时设对照组，将每条秀丽隐杆线虫取出观察，当体壁肌肉伸缩排泄到下一次排泄的时间即为排泄周期，在奥林巴斯高倍显微镜下观测，3次重复[15-16]。

8) 水提物对秀丽隐杆线虫3种抗氧化酶活力水平的影响。准确称取对照组与处理组秀丽隐杆线虫全部组织质量，按质量(g)∶体积(mL)=1∶10的比例，加入12倍体积生理盐水，冰水浴条件下手动匀浆，5 000 r/min离心5 min，取上清液待测；各组秀丽隐杆线虫超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)活性的测定，严格按照南京建成生物工程研究所生产试剂盒说明书进行[17-19]。

1.3 数据处理

试验数据用平均值±平均标准误差(S.E.M)表示，用Microsoft Excel软件绘制柱形图，用SPSS 12.0软件进行不同组别间方差分析(ANOVA)，寿命试验运用2尾检验中的两样本t-检验(Minitab Ltd.，Coventry，UK)。

2 结果与分析

2.1 体外抗氧化效果

DPPH自由基是一种稳定的自由基，因其结构简单，反应体系容易控制，多被应用于各种物质提取物或纯化合物抗氧化活性的评价和筛选[20]。O2-·是人体内产生的活性氧自由基，能引发体内脂质过氧化，加快从皮肤到内部器官整个肌体的衰老过程，并可诱发皮肤病变、心血管疾病、癌症等，严重危害人体健康，人体通过超氧化物歧化酶(SOD)将其转化成过氧化氢和氧气除去[21]。从图1可知，戈宝红麻叶片水提物对DPPH、O2-·均具有一定的清除效果，清除率与浓度呈正相关；对DPPH清除率达50%的浓度为1 000 μg/mL，相当于80 μg/mL浓度下Vc 的清除率。

还原力也是清除自由基能力评价的一个指标，依据产物生成量作为评价还原力的指标，OD值越大表明还原力越强。还原能力较强的物质，能够提供更多的电子，其供应的电子能够参与自由基反应将其变为稳定物质[21-22]。戈宝红麻叶片水提物具有较好的还原力，随着剂量增加还原力逐渐增强(图1)。

2.2 体内抗氧化效果

从图2可看出戈宝红麻叶片水提物不同浓度对秀丽隐杆线虫的寿命、头部摆动频率、排泄周期和吞咽频率和抗氧化酶活力的影响。

图1 戈宝红麻叶片水提物的还原力及对自由基的清除效果Fig.1 Reducing power and DPPH scavenging activity of aqueous extract from A. venetum leaves

注：与对照(CK)组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。Note: * and ** indicate significance of difference at P<0.05 and P<0.01 level respectively.

2.2.1 寿命 寿命是秀丽隐杆线虫经药物处理前后变化最直接的反映。与对照组相比，戈宝红麻叶片水提物10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL和1 000 μg/mL能显著延长秀丽隐杆线虫的寿命和半数致死天数，且寿命与浓度呈剂量效应。

2.2.2 头部摆动频率 秀丽隐杆线虫经药物处理后，其神经系统等功能会发生改变，头部摆动作为秀丽隐杆线虫的运动行为之一，可作为反映神经系统基本功能的指标。与对照组相比，戈宝红麻叶片水提物不同浓度处理均能显著提高秀丽隐杆线虫的头部摆动频率，且随浓度增加呈先上升后下降趋势，其中，以500 μg/mL处理秀丽隐杆线虫的头部摆动频率最高。表明，戈宝红麻叶片水提物能降低秀丽隐杆线虫的机体氧化，保护神经系统功能。

2.2.3 排泄周期 是评价秀丽隐杆线虫抗氧化的重要指标，生长状态越好其代谢能力越强，排泄周期越短。与对照组相比，戈宝红麻叶片水提物处理均能显著缩短秀丽隐杆线虫的排泄周期，其中以500 μg/mL处理的排泄周期最短。表明，500 μg/mL戈宝红麻叶片水提物能较好地维持秀丽隐杆线虫的代谢能力，提高机体抗氧化水平。

2.2.4 吞咽频率 能反映秀丽隐杆线虫的摄食能力，并且秀丽隐杆线虫的寿命可以通过咽泵运动速率间接进行评价[24]。与对照组相比，戈宝红麻叶片水提物10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL处理均能增加秀丽隐杆线虫的吞咽频率，其中，100 μg/mL和500 μg/mL处理增加显著；1 000 μg/mL处理的吞咽频率显著下降，与对秀丽隐杆线虫寿命影响相统一。

2.2.5 抗氧化酶活力 抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，SOD对机体的氧化与抗氧化水平起至关重要的作用，能清除超氧阴离子自由基保护机体免受损伤；CAT能有效清除各种活性氧基团，从而防止这些基团对细胞膜系统的破坏。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)能催化还原型谷胱甘肽(GSH)变为氧化型GSH，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害[24]。抗氧化酶活力增强，则抗氧化能力增强。与对照组相比，戈宝红麻叶片水提物10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL处理秀丽隐杆线虫的SOD、CAT、GSH活力均逐渐增强，而1 000 μg/mL处理的活力低于500 μg/mL处理，可能是浓度过高导致秀丽隐杆线虫出现机体损伤，细胞膜结构破坏，抗氧化能力减弱。

3 结论与讨论

戈宝红麻是罗布麻的一种，是我国传统的补益药，其味甘性平，具有补中益气、抗缺氧、耐疲劳、增强机体免疫力等多种作用。通过抗氧化体外试验发现，戈宝红麻叶片水提物对DPPH、O2-·自由基均具有一定的清除能力，且随质量浓度的升高清除效果增强；还原力与水提物浓度呈剂量效应，其中，以500 μg/mL水提物清除自由基的效果最好，说明戈宝红麻水提物在体外具有良好的抗氧化作用。

在体外研究基础上，为了证明提取物及纯物质在实践应用上的价值，前人多采用小鼠进行体内试验及系列指标测试。随着科技水平的不断进步，秀丽隐杆线虫因其结构简单，易于饲养，作为一种模式生物已在各个领域得到广泛应用。因此，利用模式生物秀丽隐杆线虫的寿命、抗氧化酶活力等体内各项试验指标研究发现，戈宝红麻叶片水提物能提高秀丽隐杆线虫的抗氧化能力，10 μg/mL、100 μg/mL和500 μg/mL能极显著增强其体内GSH-Px和CAT的活力，显著提高SOD的活力，其中以500 μg/mL处理的效果最好。田立等[25]研究发现，罗布麻体外具有良好的抗氧化能力及其适量多糖抑制小鼠机体过氧化物的产生。由此表明，戈宝红麻叶片水提物良好的抗氧化活性可能与其水提物中多糖有很大关系。研究结果为戈宝红麻天然保健品的开发利用提供了理论依据。