中药补肺活血胶囊对细颗粒物所致小鼠肺损伤修复的影响❋

敬 岳，金 津，唐诗环，曹乃芹，廖 强，陈 燕，蔡 哲，张洪春△

(1. 中国中医科学院望京医院，北京 100102； 2. 北京中医药大学，北京 100029； 3. 中日友好医院中医肺病科,中日友好医院呼吸中心；国家呼吸疾病临床研究中心,北京 100029； 4. 中日友好医院临床研究所，北京 100029)

细颗粒物指环境空气中空气动力学当量直径小于等于2.5 μm的颗粒物，具有粒径小、面积大、活性强的特点，容易富集空气中有毒重金属、酸性氧化物、有机污染物以及细菌和病毒等。细颗粒物在空气中停留时间长、输送距离远且从呼吸道进入人体，因此可直接引起呼吸系统疾病的发生。补肺活血胶囊主要药物组成有黄芪、赤芍、补骨脂，具有益气活血、补肺固肾的作用。相关临床及基础研究提示，补肺活血胶囊可提高机体免疫力，缓解慢性支气管炎及支气管哮喘疾病患者的相关临床症状，如咳嗽、咳痰、喘息、心悸、气短等症状[1]，也可缓解慢性阻塞性肺疾病稳定期患者的相关临床症状[2]。本研究将通过相关实验研究进一步观察补肺活血胶囊对细颗粒物所致小鼠肺损伤与修复过程的影响。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级ICR健康雌性小鼠70只，体质量18～20 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号SCXK(京)2014-0004)。在温度22～28 ℃，相对湿度50%～60%的清洁环境中饲养，适应性饲养1周，随机分为空白对照组、低剂量染毒组、低剂量染毒中药组、中剂量染毒组、中剂量染毒中药组、高剂量染毒组和高剂量染毒中药组7组各10只。

1.2 实验中药

补肺活血胶囊组成有黄芪、赤芍、补骨脂，为已上市中成药补肺活血胶囊，由雷允上药业有限公司提供，经国家食品药品监督管理总局认证通过批号(Z20030063)。

1.3 实验仪器与试剂

1.3.1 仪器 Anderson型颗粒物采样器HBL-GUV(Thermo公司)；MK3酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司)；自动控温离心机(日本 HITACHI公司)；T10 basic型自动组织匀浆机(德国 IKA 公司)。

1.3.2 试剂 细颗粒物悬液、KGF抗体(小鼠，英国 Biorbyt公司)；免疫组化试剂盒(基因科技(上海)有限公司)；IL-4、IL-17 ELISA试剂盒(小鼠，美国R&D公司)。

2 方法

2.1 细颗粒物悬液与补肺活血中药溶液制备

细颗粒物采集于2011年12月至2012年1月北京四环路中段保福寺桥和学院桥之间，用Anderson型颗粒物采样器HBL-GUV(Thermo公司)采用聚四氟乙烯滤膜采样细颗粒物，采样器安置于距道路宽2 m，距地面高1.8～2.5 m处，连续2周, 将载有颗粒物的滤膜剪裁成1 cm×3cm 大小, 浸入去离子蒸馏水中, 超声振荡40 min×3次,洗脱颗粒物, 震荡液经6层纱布过滤, 滤液4 ℃、12000 r min 离心30 min, 收集下层悬液冷冻真空干燥、 称重，低温冰箱保存备用。用生理盐水配成所需浓度后超声震荡15 min,混匀并灭菌 4 ℃保存,临用前振荡使颗粒物充分混匀。相关研究表明，我国细颗粒物水溶性无机成分主要有NO-、SO2-、NH+4、Cl-、K+[4-5]。补肺活血中药溶液制备：去除胶囊外壳将补肺活血胶囊内药粉按照一定比例与20 ℃蒸馏水充分溶解。

2.2 模型建立与干预方法

空白对照组：分别于模型建立第1、8、15和22天经鼻腔滴入0.9%生理盐水(20 μL/只)，其余时间正常饲养。细颗粒物低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组：分别于模型建立第1、8、15和22天经鼻腔滴注细颗粒物悬液1.6 mg/ kg·bw，20 μL/只； 8 mg/ kg·bw，20 μL/只；40 mg/ kg·bw，20 μL/只；中药干预组：低剂量染毒中药组、中剂量染毒中药组、高剂量染毒中药组经鼻腔滴注颗粒物剂量分别与低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组相同。

干预方法：空白对照组正常饲养。细颗粒物低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组第1天至第22天，经口灌服0.9%生理盐水0.2 ml/只/d。低剂量染毒中药组、中剂量染毒中药组、高剂量染毒中药组第1天至第22天，经口灌服补肺活血中药溶液(0.82 g/kg, 0.2 ml/只/d)，各个试验组均在最后1次染毒后48 h内处死。

2.3 取材与指标检测

2.3.1 病理学分析 脱颈处死小鼠，开胸暴露胸腔，分离靠近肺门处的左肺上叶固定于10%甲醛溶液24 h，常规脱水石蜡包埋，切片行HE染色，光镜下观察。

2.3.2 免疫组化 肺组织切片常规脱蜡后，按照免疫组化试剂盒具体操作步骤进行检测。采用美国Media Cybernetics公司生产的Image-Pro Plus图像分析软件进行分析，以累积光密度(Integrated Optical Density，IOD)反映蛋白表达总量。

2.3.3 ELISA检测 取0.1 g右侧肺叶组织放入1.5mlEP管中，制备成10%肺组织匀浆液，离心 4 ℃，12000 r/min，20 min取上清。按ELISA试剂盒提示的操作步骤说明进行肺组织匀浆上清液中相关炎性介质含量。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 中药补肺活血胶囊对细颗粒物模型小鼠肺组织病理损伤影响

图1显示，HE染色后观察小鼠肺组织，空白对照组小鼠肺组织中肺泡结构较为完整，肺泡间隔无明显增宽，炎性细胞未见异常增多，肺泡腔及血管腔中未见明显出血现象，肺组织内气道结构相对完整，气道黏膜未见明显脱落及损伤(A1)。细颗粒物模型小鼠肺泡腔明显变小，肺泡间隔明显增宽(图中蓝色箭头指示)，肺泡间隔断裂肺泡融合明显，肺泡内可见明显渗出及红细胞浸润(图中绿色箭头)，肺间质可见炎性细胞浸润，肺组织内气管可见少量气道黏膜上皮细胞脱落(图中黑色箭头指示)。且细颗粒物模型小鼠肺损伤程度可随染毒剂量加大逐渐加重(A2、A4、A6)。经补肺活血胶囊干预后，细颗粒物模型小鼠肺泡腔较前明显增大，肺泡间隔较染毒模型小鼠变薄，肺泡间隔内炎性细胞浸润程度减轻；肺泡内及肺组织间隙红细胞渗出明显减少，气管及终末细支气管中气道黏膜较为完整，未见明显黏膜细胞脱落及气道重塑(A3,A5,A7)。经补肺活血胶囊干预后，细颗粒物模型小鼠肺部炎性损伤及渗出明显缓解(A1-A7)。

注：图中蓝色箭头指示肺泡间隔明显增宽，图中绿色箭头指示肺泡内可见炎性渗出及红细胞浸润，黑色箭头指示肺间质炎性细胞浸润及肺组织内气道黏膜上皮细胞脱落图1 各实验组小鼠肺组织HE染色结果 (×200)

注：图中黑色箭头指示的褐色颗粒物为KGF表达位置。C1-C3各实验组中KGF蛋白表达总量与染毒模型组的比较:**P<0.01，*P<0.05。C4 中各实验组KGF蛋白表达总量差异无统计学意义图2 各实验小组小鼠肺组织中KGF免疫组织化学染色及KGF蛋白总量表达比较

3.2 中药补肺活血胶囊对细颗粒物模型小鼠肺组织中 KGF表达及含量的影响

图2显示，角质细胞生长因子(keratinocye growth factor KGF)免疫组织化学染色后可见KGF(棕色颗粒物)主要分布于肺泡壁内侧，肺泡与肺泡之间的组织间隙中有组织损伤的部位。空白对照组中，KGF主要表达于气管壁内侧，柱状上皮细胞(B1)。肺泡结构相对完整，肺泡及肺泡间组织中未见KGF大量表达。细颗粒物模型小鼠组中模型小鼠肺泡变小，肺泡间隔增宽，肺泡间组织中KGF表达明显增多，随染毒剂量的增加KGF在小鼠肺组织中的表达明显增多 (B2,B4,B6)。经补肺活血胶囊干预后小鼠肺组织中肺泡腔明显增大，肺泡间隔变窄，肺间质中KGF的表达明显降低(B3、B5、B7)。经补肺活血胶囊干预后小鼠肺组织结构较前明显好转，KGF分泌明显降低，小鼠肺组织修复过程缓解。通过半定量检测计算KGF在肺组织中的含量可知经补肺活血胶囊干预后肺组织中KGF蛋白表达总量明显低于染毒组(C1-C3)，但不同染毒剂量组模型小鼠肺组织中KGF蛋白表达总量未见明显差异(C4)。

3.3 实验组中小鼠肺组织中IL-4、IL-17表达

表1显示，与空白组比较细颗粒物染毒组中IL-4、IL-17在小鼠肺组织中的含量显著增多(P)，且随染毒剂量的增加IL-4、IL-17的表达进一步升高；经补肺活血胶囊干预后，IL-4、IL-17在肺组织中的表达明显下降(P)。考虑经补肺活血胶囊干预后小鼠肺组织中的炎性介质表达明显下降。

4 讨论

不同粒径颗粒物可引发不同部位的损伤，颗粒物粒径越小进入组织的部位越深。因此，细颗粒物主要进入支气管并深入肺部，最终可导致支气管哮喘急性发作，诱发支气管炎症及肺癌等呼吸系统疾病[6]。本研究明确了经鼻腔滴注细颗粒物悬液可以成功获得模型小鼠肺部损伤的模型，细颗粒物模型小鼠肺损伤主要表现为小气道、肺泡及肺间质的炎性病变。IL-4是T细胞自身分泌的生长因子，会产生免疫紊乱进而导致炎症反应的发生[7-8]。实验结果表明，补肺活血胶囊可以降低细颗粒物模型小鼠肺组织中IL-4的分泌，考虑补肺活血胶囊可通过调节免疫机制影响炎症反应的发生发展。IL-17是多种炎症反应的起始因子，可促进嗜中性粒细胞和单核细胞增殖，促进炎症募集[9]。补肺活血胶囊可有效抑制肺组织内IL-17的分泌，从而延缓细颗粒物对组织造成的炎性损伤，缓解炎症反应过程。KGF是由γδT细胞的相关因子合成,可以刺激上皮细胞增殖、分化、迁移，以促进黏膜修复完整性的维护。相关研究表明，KGF与肺纤维化有一定相关性[12]。补肺活血胶囊通过减少KGF在肺组织中的表达，减弱肺组织损伤修复过程，降低肺组织纤维样变可能。呼吸系统疾病多是由于炎性、炎症损伤、损伤后修复、纤维化的一系列病理反映过程，最终影响肺组织的整体结构和功能。通过研究发现，补肺活血胶囊可通过调节关键炎症因子的释放，缓解细颗粒物所致的炎症反应，从而减弱损伤修复所致的肺组织结构变化。

表1 各组小鼠肺组织匀浆上清液中IL-17、1 L-4含量(pg/ml)比较

注：与空白组比较:**P，*P<0.05

补肺活血胶囊由黄芪、赤芍、补骨脂组成。黄芪性甘微温，归脾、肺经，具有益卫固表、健脾补中之功；赤芍性苦微寒，归肝经，具有清热凉血、散瘀止痛之效；补骨脂性温，归肾、脾经，具有纳气平喘、补肾壮阳之功，故补肺活血胶囊具有补肺固肾、活血化瘀的功效。方中黄芪、补骨脂可调补肺肾，肺主气，肾主摄纳，故可使在体之气固守于外，在内之气固摄于内。相关临床研究表明，补肺活血胶囊可明显改善COPD患者的肺功能[1-3]，缓解矽肺患者肺部的炎性及氧化应激反应[10]。补肺活血胶囊中黄芪、补骨脂均可增强机体抵抗能力[11-12]，这与中医正气内存邪不可干的理论相吻合，与建立小鼠模型的同时给予中药干预和中医治未病理论相符。中医理论认为空气中细颗粒物即为外邪，结合颗粒物性质空气中颗粒物为阴邪、寒湿邪，为疫戾之气。由于外邪入侵机体出现正邪相争，正气盛则邪气难以入侵，邪气盛则为病。空气中细颗粒物首犯机体肺卫，使气血运行失司，因此可见痰浊瘀血停滞体内。扶助正气是防止疾病发生发展的重要环节，补肺活血胶囊中黄芪、补骨脂均可补益正气，赤芍则可活血通经以防痰浊瘀血内停。补肺活血胶囊在提高机体免疫力、增强机体正气的同时，可以预防疾病的发生发展，以达到“治未病”的目的，该研究也可为防治颗粒物所致呼吸系统疾病提供新的研究思路和方向。