不同底物间接免疫荧光对自身免疫性表皮下水疱病诊断的评价

于灵 冯素英 李志量 靳培英 王宝玺

1中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院皮肤科江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室，南京210042；2中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院皮肤科，北京100144于灵现在河南省人民医院皮肤科，郑州450003

由于自身免疫性表皮下水疱病患者体内存在抗基底膜带中起真表皮连接作用的相关蛋白的抗体，导致基底膜带结构破坏，发生真表皮分离。基底膜带连接结构相对复杂，根据破坏结构及患者体内相应抗体的不同，自身免疫性表皮下水疱病存在较多类型，如大疱性类天疱疮（bullous pemphigoid，BP）、瘢痕性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa acquisita，EBA）、大疱性系统性红斑狼疮、扁平苔藓样类天疱疮、线状IgA 大疱性皮病（linear IgA bullous dermatoses，LABD）、P200类天疱疮等［1］，其对应临床上表现也略有不同。诊断上，除组织病理可见表皮下水疱形成外，免疫病理对于明确诊断至关重要。直接免疫荧光法可见免疫球蛋白IgG、IgA和/或补体C3沿基底膜带呈线状沉积，但其阳性并不足以将各类自身免疫性表皮下水疱病区分开来；而间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）更为方便，且可多次进行，其中盐裂皮肤IIF对于表皮下水疱病的诊断更为重要［2-3］。本文探讨以正常人皮肤（normal human skin，NS）、猴食管（monkey esophagus，ME）及盐裂皮肤（salt-split skin，SS）为底物行IIF，检测自身免疫性表皮下水疱病循环抗体的沉积情况及其敏感性和特异性，为其在自身免疫性表皮下水疱病诊断中的应用提供参考。

资料与方法

一、临床资料

收集2015年1月至2016年12月在中国医学科学院皮肤病研究所就诊的自身免疫性表皮下水疱病患者56 例。患者符合以下诊断标准：①临床表现为皮肤或黏膜部位紧张性水疱；②皮肤组织病理表现为表皮下水疱病；③皮肤组织直接免疫荧光显示免疫球蛋白IgG和/或IgA、补体C3沿基底膜带呈线状沉积。除符合上述标准外，BP患者还需BP180抗体检测阳性；EBA患者还需行Ⅶ型胶原抗体检测阳性；P200 类天疱疮患者需通过免疫印迹检测患者血清中存在与真皮侧相对分子质量200 000蛋白结合的抗体，在200 000 处可见条带；LABD 患者除符合①、②外，需直接免疫荧光显示IgA 沿基底膜带呈线状沉积。纳入的自身免疫性表皮下水疱病患者中BP 47 例，男29 例，女18 例，年龄21 ～94（67.4±16.9）岁；EBA 6例，男4例，女2例，年龄7 ～99（35.2 ± 35.7）岁；LABD 2 例，男性，分别2 岁、22 岁；P200 类天疱疮为1 例56 岁男性。对照组为诊断明确的天疱疮患者70 例，慢性湿疹15 例和健康成人15例，BP180抗体检测均阴性。本研究通过中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准［（2014）快审第（KY004）号］，所有受试者均签署知情同意书。

二、方法

1.血清采集：病例组患者及对照组均使用促凝管留取外周静脉血5 ml，将所收集血样标本离心后将血清分装置于-80 ℃冰箱保存待检。

2.试验材料：正常人皮肤取自皮肤外科整形手术后残留的正常皮肤，OCT 包埋后制成冰冻切片。盐裂皮肤来自外科的正常人皮肤制备的盐裂皮肤冰冻切片［4］。猴食管上皮IIF 检测试剂盒［欧蒙医学诊断（中国）有限公司］，异硫氰酸荧光素标记山羊抗人IgG 抗体（FITC-IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司），BP180 抗体检测试剂盒（日本MBL公司）。

图1 不同底物间接免疫荧光阳性表达模式 1A、1B：大疱性类天疱疮患者以正常人皮肤、猴食管为底物时荧光物质沿基底膜带呈线性沉积；1C：大疱性类天疱疮患者以盐裂皮肤为底物IgG线性沉积于表皮侧；1D：获得性大疱性表皮松解症患者以盐裂皮肤为底物IgG线性沉积于真皮侧

3.酶联免疫吸附测定（ELISA）：按照BP180 抗体检测试剂盒说明书操作，检测BP 患者BP180 抗体滴度，酶标仪读取吸光度后，按照说明书提供的公式计算血清抗体滴度值。

4.IIF：将制好的正常人皮肤、盐裂皮肤冰冻切片用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3 次，晾干后滴加受试者血清（1∶10）于37 ℃孵育30 min，PBS 洗3 次，滴加FITC-IgG（1∶50）于37 ℃孵育30 min，PBS 洗3次，使用荧光显微镜观察荧光表达情况。猴食管IIF按照试剂盒说明书操作。

5.荧光结果判读：基底膜带荧光物质呈线状沉积为阳性。由2 名有经验的研究者独立判读和分析，有争议时由第三方有经验的研究者独立判读及分析，决定最终结果。根据荧光结果计算IIF 检测的敏感性与特异性，敏感性=真阳性人数/（真阳性人数+ 假阴性人数）×100%；特异性=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）×100%。

6.统计学方法：采用SPSS 13.0 软件，计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验及Fisher精确检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、不同底物IIF阳性表达模式

所有IIF 阳性患者均有荧光物质沿基底膜带呈线性沉积。以盐裂皮肤为底物BP患者44例可见荧光线性沉积于表皮侧，EBA 和P200 类天疱疮7 例均见线性沉积于真皮侧（图1）。另有2例寻常型天疱疮患者在以正常人皮肤为底物、2例BP患者在以正常人皮肤和盐裂皮肤为底物时表现为基底膜带及棘细胞间荧光物质沉积。

对照组100例中有2例天疱疮患者在以正常人皮肤和盐裂皮肤为底物时出现荧光物质沿基底膜带及棘细胞间沉积，1例慢性湿疹患者在以盐裂皮肤为底物时出现荧光物质沿基底膜带沉积，其余均为阴性。

二、不同底物IIF的敏感性与特异性

以正常人皮肤、猴食管、盐裂皮肤为底物的IIF对表皮下水疱病诊断的敏感性分别为73.2%、60.7%、94.6%，对BP 诊断的敏感性分别为74.5%、63.8%、93.6%，差异均有统计学意义（P＜0.05），以盐裂皮肤为底物时对表皮下水疱病、BP 诊断的敏感性高于以正常人皮肤、猴食管为底物（均P＜0.05）。见表1、2。

表1 以正常人皮肤、猴食管、盐裂皮肤为底物间接免疫荧光检测表皮下水疱病的敏感性（%）

表2 不同底物间接免疫荧光检测大疱性类天疱疮及表皮下水疱病的敏感性比较

以正常人皮肤、猴食管、盐裂皮肤为底物的IIF对于表皮下水疱病诊断的特异性分别为98.0%、100%、97.1%，差异无统计学意义P＞0.05。

三、BP患者BP180抗体滴度比较

BP 患者BP180 ELISA 抗体滴度为94.1 ± 64.3（11.4 ～＞150）U/ml，以猴食管为底物时IIF阴性与阳性患者滴度分别为81.9 ± 49.5、101.1 ± 71.2，差异无统计学意义（t=-0.984，P＞0.05）。

讨论

IIF作为一种重要的实验室检测方法应用于自身免疫性表皮下水疱病的诊断，其中盐裂IIF 有着更为重要的意义，可用于自身免疫性表皮下水疱病的初步分类［4-5］。既往研究表明［6］，对于自身免疫性表皮下水疱病，盐裂皮肤IIF 诊断敏感性较高。尽管新的检测手段如酶联免疫吸附试验（ELISA）［7-9］等使诊断更加准确，但因IIF简单、无创、易行，底物较易获取，且价格低廉，适合临床广泛应用而仍有其存在的价值。

本研究对比了正常人皮肤、猴食管与盐裂皮肤三种不同底物在自身免疫性表皮下水疱病诊断中的敏感性。以盐裂皮肤为底物，IIF 敏感性优于正常人皮肤和猴食管，且差异均有统计学意义，因此，对于自身免疫性表皮下水疱病，盐裂皮肤可替代正常人皮肤和猴食管为底物进行IIF，且其阳性率更高。Sárdy 等［10］曾评价以猴食管和盐裂皮肤IIF 的敏感性及特异性，敏感性分别为73.2%、73.3%，特异性可达97.1%、100%，与本研究数据大致相符。而对于BP，盐裂皮肤IIF敏感性同样高于猴食管和正常人皮肤，且盐裂皮肤与猴食管及正常人皮肤间差异均有统计学意义。本研究对照组中2 例天疱疮及1 例湿疹患者同样出现了基底膜带荧光物质沉积，考虑存在假阳性可能，或因抗原表位扩展而导致基底膜带荧光阳性。由于以正常人皮肤与盐裂皮肤为底物时BP患者IIF阴性例数较少，以猴食管为底物时阴性例数相对较多，我们比较了以猴食管为底物时IIF 阳性与阴性患者BP180 滴度水平，两者抗体滴度无显著差异，说明IIF 阳性与否与BP180抗体滴度水平无关。

综上所述，盐裂皮肤IIF 为一种重要的自身免疫性表皮下水疱病诊断方法，其敏感性明显优于正常人皮肤及猴食管为底物IIF，且可根据盐裂皮肤IIF 荧光沉积情况对表皮下水疱病进一步分类诊断。其优点除了简单易行外，盐裂皮肤底物较猴食管更易获得，且价格低廉。猴食管确已商业化，但价格昂贵，不适合临床广泛应用，且敏感性较盐裂皮肤低，同时猴与人种属不同，猴食管存在不能识别部分人源抗体的问题，因此盐裂皮肤IIF 为更加理想的诊断方法。当然，与使用ELISA检测循环抗体的方法相比，IIF仍存在一定的局限性，其判断更为主观，需要有经验的临床医生进行判断，且同样存在假阳性及假阴性可能，因此有条件的情况下可联合ELISA方法更加准确地诊断。