白细胞介素-8基因多态性与艰难梭菌 感染之间关系的研究

李 婷 王红玲 刘 适 王爱平

海南省三亚市人民医院消化内科1(572000) 武汉大学中南医院消化内科2

背景：艰难梭菌是院内感染的常见原因，在炎症性肠病(IBD)中的感染率较高，而白细胞介素-8(IL-8)在艰难梭菌的炎症反应中起有重要作用。目的：探讨IL-8-251位点A/T基因多态性与艰难梭菌感染之间的关系。方法：选取2011年12月—2013年1月武汉大学中南医院就诊的173例IBD患者、76例肠易激综合征患者，以90名正常人群作为对照组。以聚合酶链反应(PCR)法检测粪便中艰难梭菌感染情况，Sanger测序法测定IL-8-251位点A/T基因多态性，并分析艰难梭菌感染与IL-8-251位点A/T基因多态性的关系。结果：共检出艰难梭菌阳性者31例(9.1%)。艰难梭菌阳性患者IL-8-251位点AA基因型比例显著高于艰难梭菌阴性患者(χ2=96.671 8，P<0.000 1)。结论：IL-8-251位点AA基因型可能是艰难梭菌感染的危险因素，可增加感染艰难梭菌的机会。

艰难梭菌(Clostridiumdifficile)是一种革兰阳性、专性厌氧的粗大杆菌，有鞭毛，可形成芽孢。艰难梭菌毒素A(肠毒素)、艰难梭菌毒素B(细胞毒素)是其主要的致病毒素，分别由基因tcdA、tcdB编码，两者存在协同作用，可共同导致艰难梭菌相关性腹泻(Clostridiumdifficile-associated diarrhea, CDAD)的发生，并可使CDAD进一步演变为伪膜性肠炎。但近年有研究报道了tcdB阳性而tcdA阴性的艰难梭菌[1-2]，引起了人们对tcdB的重视。据美国一项调查研究显示，20%的医院内腹泻由艰难梭菌感染引起[3]。有研究发现，艰难梭菌在炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)患者中有较高的感染率[4]。近年有报道发现，部分急性胃肠道感染者治愈后出现了肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)的症状，并提出了感染后IBS的概念[5]。白细胞介素-8(interleukin-8， IL-8)是一种炎症性细胞因子，属于趋化因子超家族，可强有力地使中性粒细胞趋化，在艰难梭菌感染的炎症反应中起重要作用。有研究表明，IBD患者粪便中IL-8表达水平显著增加，IL-8可趋化中性粒细胞游走并集合至炎症部位，加重IBD患者的病情。IL-8启动子区序列有九种变异型，但仅251位点与粪便中IL-8浓度增加有关[6]。本研究通过检测IBD、IBS患者和正常人群中艰难梭菌的感染情况以及IL-8-251位点A/T基因多态性，旨在探讨两者之间的关系。

材料与方法

一、标本来源

选取2011年12月—2013年1月武汉大学中南医院消化内科和肛肠科就诊的173例IBD患者[其中包括90例溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)患者和83例克罗恩病(Crohn’s disease, CD)患者]和76例IBS患者。173例IBD患者中，男87例，女86例；年龄14～78岁，平均(34.50±3.55)岁；76例IBS患者中，男37例，女39例；年龄22～67岁，平均(32.72±4.06)岁。IBD的诊断依据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[7]，结合患者的临床表现、内镜下表现和组织病理学进行综合分析；IBS的诊断符合罗马Ⅲ的诊断标准[8]，同时经血、尿、粪、甲状腺和肠道检查排除其他器质性疾病。排除标准：①患有慢性心、肺、肝肾功能损害等慢性基础病；②长期规律或不规律服用某种药物者；③经常有腹部不适症状、排便不规律、性状不正常者。以同期90名健康志愿者设为正常对照，其中男45名，女45名；年龄18～62岁，平均(34.56±4.37)岁。三组患者的性别构成、年龄相比差异无统计学意义(P>0.05)。本研究方案由武汉大学中南医院伦理委员会审批通过，入选者均取得知情同意。

详细记录患者的病史和基本信息，研究对象全部为汉族，同时收集每例患者的粪便和血液标本，标本量不足以及其他原因不能进行研究者的标本排除在外。

二、方法

1. 标本的收集和处理：收集入选者未使用任何药物前的第一次排便，置于-80 ℃冰箱冻存待测；抽取入选者空腹外周静脉血2 mL，-80 ℃冰箱冻存待测。

2. 不同基因组DNA的提取：粪便基因组DNA的提取采用美国QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。血液基因组DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Blood DNA Kit，具体操作步骤按试剂盒说明书进行；艰难梭菌标准菌株购自中国微生物菌种保藏中心，使用CCFA培养基(头孢甲氧噻吩-环丝氨酸-果糖-黄琼脂)厌氧培养48 h，菌株基因组DNA的提取采用美国OMEGA公司E.Z.N.A.TMBacterial DNA Kit，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

3. PCR法检测粪便中艰难梭菌毒素B：由生工生物工程(上海)股份有限公司设计针对艰难梭菌毒素B保守区的引物序列，上游：5’-TGC ACT TTG AAG AAA AAG GAG C-3’，下游：5’-TGG GTC TAT TCC TAC TTC TAA TGC T-3’，产物大小173 bp。PCR反应体系共25 μL，内含上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、2×PCR MIX(武汉众一生物试剂公司)12.5 μL、超纯水7.5 μL、DNA模板3 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。以艰难梭菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照，超纯水作为阴性对照。

4. Sanger测序法测定IL-8-251位点A/T基因多态性：由生工生物工程(上海)股份有限公司设计IL-8引物序列，上游：5’-CCT TAC ATT GCT TTC TTC TTC TG-3’，下游：5’-TGC ACC CTC ATC TTT TCA TT-3’，产物大小661 bp。PCR反应体系共50 μL，内含上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、基因组DNA模板2 μL、ddH2O 22 μL、2×Taq PCR Master Mix(武汉众一生物试剂公司)25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物行Sanger测序，用DNAMAN进行序列比对，同时打开峰图查看待检测位点的荧光信号。

三、统计学分析

采用SAS 9.2统计软件，计量数据的比较采用χ2检验，非正态资料的比较用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、艰难梭菌的感染情况

173例IBD患者中，共检出艰难梭菌感染者28例，包括15例UC患者和13例CD患者；76例IBS患者中检出2例艰难梭菌感染阳性；90名正常对照组检出1名阳性感染者(表1)。

二、IL-8-251位点A/T基因多态性

IL-8-251位点的不同基因多态性见图1。不同组别中艰难梭菌阳性感染者的IL-8-251位点AA基因型所占比例较高(表2)。艰难梭菌阳性者AA基因型比例显著高于艰难梭菌阴性者(χ2=96.671 8，P<0.000 1)(表3)，提示IL-8-251位点AA基因型可能是艰难梭菌感染的危险因素。

讨 论

艰难梭菌感染相关性疾病的发病率正逐步增高，已成为医院内感染的重要因素[9]。根据美国疾控预防中心的统计，每年感染艰难梭菌的病例约250 000 例，死亡率为1%～2.5%[10]。近年，随着艰难梭菌感染病情严重程度的增加，其治疗存在一定难度。医院获得性艰难梭菌感染还可显著增加患者的住院时间，而与基础的死亡风险无关[11]。艰难梭菌感染的相对危险因素包括使用广谱抗菌药物、伴有严重的基础疾病、使用质子泵抑制剂、处于免疫抑制状态、使用激素、老龄、近期有手术史以及出现毒力更强的新型产毒菌株等[12]。IL-8是一种炎症因子，在中性粒细胞趋化以及炎症反应过程中起有重要作用，已有研究表明，IL-8基因启动子区251位点与粪便中IL-8浓度增高有关[6]。IL-8-251位点A/T基因多态性对初发性或复发性艰难梭菌感染而言可能均为危险因素，该位点为AA基因型者的艰难梭菌感染率较高[6，13-14]。本研究中，UC、CD患者艰难梭菌阳性感染者的AA基因型比例较高，2例艰难梭菌阳性的IBS患者均为AA基因型，1例艰难梭菌阳性的正常对照者亦为AA基因型。此外，艰难梭菌阳性者的AA基因型比例显著高于艰难梭菌阴性者(P<0.000 1)。提示IL-8-251位点AA基因型更容易发生艰难梭菌感染。

表1 各组艰难梭菌的感染情况 (n)

表2 各组艰难梭菌阳性、阴性患者IL-8-251位点A/T基因多态性比较(n)

表3 不同艰难梭菌感染组IL-8-251位点A/T基因型比较 n (%)

图1 IL-8-251位点的基因多态性

总之，目前关于艰难梭菌与遗传学、基因学之间关系的研究少见。本研究发现，IL-8-251位点AA基因型可能是艰难梭菌感染的危险因素，从而将艰难梭菌感染与遗传学方面建立起了某种联系，为研究艰难梭菌感染提供了新的思路。但本研究也受到一定的限制，如样本量较小、未能区分初发型和复发型IBD患者，未来需行更深入的研究来进一步探讨IL-8与艰难梭菌感染的关系。