白茶提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的影响

周 方，张杨波，郑 新，林海燕,3*

(1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙410128；3.湖南省植物功能成分利用协调创新中心，湖南 长沙 410128)

白茶是我国特种茶之一，发源于中国福建福鼎，具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤和降血压、降血脂、降血糖等功效[1]。不同年份的白茶化学成分含量不同，其儿茶素组分含量总趋势一致，表现为EGCG（表没食子酸儿茶素没食子酸酯）>ECG（表儿茶素没食子酸脂）>EGC（表没食子酸儿茶素） >EC（表儿茶素） >C（儿茶素），即酯型儿茶素比例较高。白茶中含有咖啡碱、可溶性糖、氨基酸和黄酮类等物质，对茶叶的品质及药理功效起到了重要的作用[2]。

炎症是病原微生物侵入机体内造成机体内一系列不正常的病理性反应，而且在炎症的整个过程都受到炎症相关信号分子的严格调控，这些信号分子与炎症的发生、维持和消退有着密切联系。白茶中含有大量的茶多酚、茶氨酸等生物活性成分，研究发现这些活性单体成分在许多体外细胞实验和体内动物实验中具有较好的抗炎功效[3-5]。

本实验选用LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7建立炎症反应模型[6]，选用一氧化氮（NO）与白介素-6（IL-6）这两个炎症因子探讨白茶提取物对RAW264.7的抗炎效果[7-8]；探究白茶提取物对一氧化氮合酶（iNOS）与IL-6等mRNA表达的影响及其在核酸水平上的作用效果。本研究通过建立炎症模型，研究白茶提取物抗炎功效，为后续研究老年衰退性疾病与代谢综合征提供参考。

1 材料与仪器

细胞RAW264.7小鼠巨噬细胞株系（自中国医学科学院细胞中心）；新白茶（2018年白牡丹，福建品品香公司）、陈年白茶（2014年白牡丹，福建品品香公司）；噻唑蓝（Amresco)；DMSO、LPS、吲哚美辛（Sigma）；胎牛血清(Hyclone)；PBS（索莱宝）；qPCR引物（上海生工）；DMEM培养基（上海生工）；胎牛血清（BI）；SYBR荧光染料（TakaRa）；NO试剂盒（碧云天）；总RNA提取试剂盒 （全式金）；RNA反转录试剂盒（全式金）。

旋转蒸发浓缩仪(EL-131 Buchi)；高速冷冻干燥机（Christ）；超净工作台（力康opticlean-1300）；CO2培养箱 （Nuaire）；倒置显微镜 （Leica Microsystems）；荧光定量PCR仪（Thermo）；多功能酶标仪（Thermo）；普通离心机（Rotina）；精密电子天平（Starorius）等。

2 实验方法

2.1 白茶提取物的制备

称取不同年份白茶茶样100 g，加入1000 mL沸水水浴加热30 min，过滤后再加入沸水定容500 mL，水浴25 min，合并滤液经冷冻干燥48 h制成茶粉，-20℃保存备用。

2.2 白茶提取物主要成分测定

茶多酚的测定采用福林酚比色法，参照国家标准GB/T8313-2008；黄酮类化合物总量测定采用三氯化铝比色法[9]；游离氨基酸的测定参照国家标准GB/T8314-2013；儿茶素组分、生物碱和没食子酸含量的测定采用HPLC检测法[10]。

2.3 RAW264.7细胞培养与分组

液氮冻存的RAW264.7小鼠巨噬细胞系复苏后，放置于5%CO2、37℃培养箱中培养。细胞密度达70%～80%时，按照1∶4至1∶8比例传代。当细胞处于对数生长期时即可进行实验。

空白对照组（control）：不做任何处理，正常培养24 h；炎症模型组：1 μg/mL LPS持续刺激细胞24 h；处理组：不同浓度白茶提取物（10 μg/mL、30 μg/mL 和 50 μg/mL） 处理细胞24 h；LPS（1μg/mL） 和不同浓度白茶提取物（10 μg/mL、30 μg/mL 和 50μg/mL） 共同处理细胞 24 h；不同浓度 EGCG（1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μM） 单独处理细胞24 h； LPS（1 μg/mL） 和 不 同 浓 度 EGCG（1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和 20 μM） 共同处理24 h；阳性药物组：1 μg/mL LPS和 20 μg/mL吲哚美辛[11]共同处理细胞24h。

2.4 RW264.7细胞炎症模型的建立

收集对数生长期的细胞，按1×104密度接种于96孔板，待细胞生长到对数生长期时用移液枪吸出每孔旧的培养液，分别加入含有不同浓度 （0 μg/mL、1μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL） LPS的培养基，培养24 h后取上清培养液，于3000 rpm、4℃离心10 min，取上清液用于NO试剂盒检测炎性因子NO的分泌量；与上述操作一致的96孔板中加入MTT染色，培养箱内培养4 h后弃上清液，加入DMSO（150 μL/孔），摇床上轻晃10 min使细胞内晶体完全溶解后，酶标仪检测吸光度值OD（波长为570 nm）以检测LPS对细胞活力影响。具体计算公式如下：

2.5 MTT法检测白茶提取物对RAW264.7细胞活力影响

收集对数生长期的细胞，按1×104密度接种于96孔板。24 h后，空白组不作任何处理；模型组按照LPS最佳浓度诱导；处理组用不同浓度白茶提取物（10μg/mL、30 μg/mL和 50 μg/mL） 单独处理细胞以及LPS（1μg/mL） 和不同浓度白茶提取物 （10 μg/mL、30 μμg/mL和50 μg/mL） 共同处理细胞。24 h后采用MTT法检测细胞相对活力。

2.6 中性红法测定巨噬细胞吞噬活性

收集对数生长期的细胞，按1×104密度接种于96孔板。48 h后，每孔加入0.075%中性红生理盐水溶液100 μL，继续培养4 h，吸取上清液，用PBS缓冲液清洗3次，每孔加入细胞裂解液（冰醋酸:乙醇=1:1） 100μL，4℃下放置2 h，待细胞裂解后测定吸光度值OD（波长为540 nm）。

2.7 NO试剂盒检测炎症因子NO的分泌情况

将RAW264.7细胞株系以1×104密度接种于96孔板，模型组LPS诱导炎症，按上述分组处理细胞。24 h后，用NO试剂盒检测NO浓度，按照说明书操作，最后用酶标仪检测吸光度值（波长为540 nm）。

2.8 iNOS和Il-6基因表达的测定

提取细胞的总RNA，将RNA反转录成cDNA，荧光定量qPCR检测炎症因子iNOS和Il-6 mRNA基因表达。各待测基因mRNA序列从NCBI中获取，引物由primer 6设计，按表1合成。并按20 μL反应体系：SYBR Green Mix 10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物各 0.4 μL （10 μmol/L），cDNA 2μL，RNase-free H2O 6.8 μL；反应条件如下：95℃变性10 min；95℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 20 s，共 40个循环；95℃ 30 s，55℃30 s，95℃30 s。每个标本均作三个复孔，复孔间的Ct值差异控制在0.5以内。

待测基因样本的mRNA相对表达量的计算采用以下公式：

待测基因样本mRNA相对表达量=2-△△Ct

2.9 统计方法

所有实验重复三次，采用GraphPad Prism 7软件分析数据，所有数据均采用平均值±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 内参及目的基因荧光定量PCR反应的引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescent quantitative PCR reaction of reference and target genes

3 结果与分析

3.1 白茶提取物中主要化学成分含量

由表2可知，在白茶提取物中，茶多酚含量最高，其中2018年白茶的茶多酚含量达到了23.15%，比2014年白茶茶多酚含量高出1.91%；贮藏过程中，游离氨基酸、EGCG和EGC含量具有小幅度下降，但是咖啡碱含量基本上保持一致，这与咖啡碱是嘌呤碱杂环化合物，具有环状结构而相对比较稳定有关；2018年白茶的黄酮含量为5.64 mg/g，2014年白茶的黄酮含量为5.98 mg/g，上升幅度为6.03%，原因可能是茶叶在贮藏过程中酚类物质发生转化，形成了黄酮类物质[12]。

表2 白茶提取物中主要化学成分含量Table 2 Contents of main chemical components in White tea extract

3.2 RAW264.7细胞炎症模型的建立

荧光显微镜下观察RAW264.7细胞形态学结构，生长速度较快，簇状生长，当细胞还未贴壁时，细胞呈圆形或椭圆形，其细胞质有一环“光圈”，折光透明光亮。如图1-A所示，RAW264.7细胞传代后可在2～4 h内贴壁，一般一小时后就可牢固贴壁了，贴壁后大多数也是呈圆形或椭圆形生长。模型组给予1μg/mL LPS刺激后，细胞会变为类似四角形或多边形，细胞质出现颗粒性物质，并且都伸出伪足之类，胞体变大，簇状生长消失，见图1-B。结果与邓延珍的研究一致[13]。

图1 倒置显微镜下细胞形态Fig.1 RAW264.7 cells under inverted microscope

如图2-A所示，小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7 分别在 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL和10μg/mL的LPS刺激诱导下，均能显著提高炎症因子NO的分泌量，且呈剂量关系，表现极显著性差异（P＜0.05）。通过比较细胞活力大小来评估四种浓度对细胞活性的影响，如图2-B所示，1μg/mL LPS细胞的相对活力与正常组相比相对活力相差不大，2μg/mL、5μg/mL和10 μg/mL LPS均能显著提高细胞相对活力，对RAW264.7细胞有增殖的效果。综合分析得出，1μg/mL LPS能够诱导巨噬细胞RAW264.7产生炎症反应，并对细胞活力无影响，因此选用1 μg/mL的LPS诱导RAW264.7建立细胞炎症反应模型，这与Swirski F K实验建模方法一致[14]。

3.3 白茶提取物对细胞活力的影响

图2 不同浓度LPS诱导RAW264.7细胞中NO含量和细胞活力的影响Fig.2 Effects of different concentrations of LPS on NO content and cell viability in RAW264.7 cells A:NO content;B:Relative cell viability

MTT法可以检测细胞存活和生长，其原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为蓝色的甲臜（Formazan），后者溶于有机溶剂（如二甲基亚砜、无水乙醇或酸化异丙醇等），产量与活细胞数成正比[15]。与对照组比较，EGCG和白茶提取物对细胞相对活力没有显著变化，说明此实验条件下该浓度范围内的EGCG、白茶提取物均未对细胞的活性造成显著影响（图3）。

图3 不同处理对RAW264.7细胞活力的影响Fig.3 Effects of different treatments on the viability of RAW264.7 cells

图4 不同处理对RAW264.7巨噬细胞吞噬活性的影响Fig.4 Effects of different treatments on the phagocytic activity of RAW264.7 macrophages

图5 不同处理对LRS诱导RAW264.7细胞NO表达的影响Fig.5 Effects of different treatments on No expression RAW 264.7 cells induced by LPS

3.4 不同处理对RAW264.7细胞吞噬活性的影响

有研究结果表明，20μmol/L的EGCG可以降低巨噬细胞的炎症反应，并提高吞噬活性[16]。如图4-A所示，用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的吞噬活性相比于正常细胞是显著变化的，当使用不同浓度的EGCG（1 μM、5 μM、10μM和20 μM）处理时，结果发现20 μM的EGCG能够有效提高巨噬细胞的吞噬活性。由图4-B实验结果表明，白茶提取物均能显著提高RAW264.7细胞的吞噬活性，白茶提取物具有活化RAW264.7细胞，提高吞噬能力的作用，可保护机体免受抗原感染。

3.5 不同处理对LPS诱导RAW264.7细胞后NO表达的影响

EGCG具有较好的抗炎作用[17-18]。如图5-A所示，LPS诱导RAW264.7细胞的NO释放量显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，EGCG能够极显著的抑制RAW264.7细胞中NO的产生，且具有显著性差异（P＜0.05）。采用新、陈年白茶提取物作为处理组，分别加入10 μg/mL、30 μg/mL 和 50 μg/mL 的茶叶提取物+LPS（1 μg/mL） 共同作用 RAW264.7细胞。实验结果如图5-B所示，新白茶提取物和陈年白茶提取物均能有效抑制RAW264.7细胞中NO的产生，且具有极显著性差异（P＜0.05），且陈年白茶提取物的抑制效果优于新白茶提取物。白茶加工工艺简单，经萎凋干燥制作而成，鲜叶中的多酚与咖啡碱等物质损耗较低，这些物质能抑制NF-KB信号途径的激活下调iNOS表达[19-20]。

3.6 不同处理对LPS诱导RAW264.7细胞中炎症因子转录表达的影响

诱导性一氧化氮合酶（iNOS）是调节炎症反应的蛋白酶，细胞在正常情况下不表达，当细胞被LPS刺激活化时，炎症反应激活，诱导细胞分泌iNOS基因表达，分泌NO炎症因子，使炎症程度加重[21]。如图6所示，相比于正常组，模型组细胞中的iNOS和IL-6 mRNA水平显著提高（P＜0.05）；50μM、100μM和20μM的EGCG浓度均可显著抑制iNOS与iL-6在mRNA水平上的表达。如图7所示，10 μg/mL、30μg/mL和50 μg/mL陈年白茶可降低iNOS与IL-6 mRNA表达水平，呈剂量正相关。由此可证明陈年白茶提取物高剂量组对IL-6和iNOS mRNA水平转录抑制作用优于吲哚美辛。从图8所示，将相同浓度（10 μg/mL）的陈年白茶提取物和新白茶提取物对iNOS与IL-6 mRNA表达水平进行比较，发现陈年白茶提取物和新白茶提取物均能够显著抑制IL-6和iNOS mRNA水平转录，抑制效果与阳性药物组吲哚美辛基本一致。可能是白茶中茶多酚、黄酮类和咖啡碱等活性成分共同作用的结果，其有效地抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症。

图6 EGCG对LPS诱导RAW264.7细胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相对表达的影响Fig.6 Effect of EGCG on the relative expression of iNOS（A） and IL-6（B） in RAW264.7 cells induced by LPS

图7 陈年白茶提取物对LPS诱导RAW264.7细胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相对表达的影响Fig.7 Effect of old white tea extract on the relative expression of iNOS（A） and IL-6（B） in RAW264.7 induced by LPS

图8 茶提取物对LPS诱导RAW264.7细胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相对表达的影响Fig.8 Effect of tea extract on the relative expression of iNOS （A） and IL-6（B） in RAW264.7 induced by LPS

4 结论与讨论

NO作为一种生物学活性物质，除了在中枢神经系统作为重要的信号传递物质外，还广泛参与了包括免疫反应在内的机体多系统的生理和病理过程[22-24]，巨噬细胞受到刺激活化时，会释放大量的NO杀死机体内病原微生物等来诱导炎症反应以抵御外界不利因素的侵害。NO的表达是通过其上游关键酶iNOS来控制的。

白茶提取物中含有大量的茶多酚、氨基酸和咖啡碱等活性成分，并且通过体外实验或体内动物实验，都已经被证实了可以通过抑制NF-KB通路的激活而表现出来一定程度的抗炎功效[3,5,16,20]。试验结果表明白茶提取物能够抑制RAW264.7细胞中NO的产生，且具有极显著性差异（P＜0.05），呈剂量依赖性，并且陈年白茶提取物的抑制效果优于新白茶提取物；通过进一步检测白茶提取物对NO的上游关键酶iNOS mRNA表达和促炎因子IL-6的mRNA表达的影响，发现白茶提取物能够显著抑制IL-6和iNOS mRNA水平转录，抑制效果与阳性药物组吲哚美辛相比基本一致。

本研究表明了白茶提取物能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症，且陈年白茶提取物的抑制效果优于新白茶提取物。其中可能的原因为：第一，白茶制作工艺过程中多酚与咖啡碱的损耗较低，而咖啡碱与茶多酚能够抑制NF-KB信号途径的激活，下调iNOS表达[20]；第二，黄酮是抑制炎症反应中的重要活性物质[25]。通过对比陈年白茶提取物与新白茶提取物生化成分发现，陈年白茶提取物中黄酮含量比新年白茶提取物含量高出6.03%，这与周琼琼等人[26]研究结果一致；第三，可能是白茶中茶多酚、黄酮类、咖啡碱等活性成分共同作用的结果；Ho等[27]研究表明，龙眼花提取物抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO是由于多酚类、黄酮类、原花青素类等共同作用的结果，而不仅仅是单一的酚类物质。

本试验仅进行体外抗炎研究，仍需进一步的体内动物实验进行验证，对NF-KB蛋白p65、NF-KB p50蛋白的表达影响等还需要进一步研究以便开发白茶提取物的抗炎活性功效。综上所述，本实验初步探讨白茶提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的影响，发现白茶提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症具有一定的抑制作用，这对今后研究白茶提取物抗炎功效，为后续研究老年衰退性疾病、代谢综合征和白茶功效研究等提供参考。