基于二代测序分析肺癌脑转移与非脑转移分子差异

尤 涛，张广超，吕晓鹏，刘志刚，王东旭，刘 金

(吉化集团公司总医院 放射治疗科，吉林 吉林132021)

中国是肺癌高发国家，每年新增患者73.3万，死亡人数达到61.0万，肺癌已经成为中国恶性肿瘤中的第一杀手[1]。相比于传统的检测方法，利用二代测序技术对肺癌进行基因层面的突变检测，已在疾病早筛、靶向治疗、复发监测等领域体现出强大的优势。循环肿瘤DNA来自于凋亡或者坏死的肿瘤细胞，在很大程度上可以反映肿瘤的分子特征。本研究通过比较非小细胞肺癌患者中，发生脑转移与未发生脑转移患者循环肿瘤DNA的突变差异，探究非小细胞肺癌中脑转移的分子突变特征。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至12月在吉林市化工医院入院治疗的非小细胞肺癌患者共20例，其中男性6例，女性14例，年龄54-85岁，平均年龄70.85± 8.92 岁。经组织病理学确认患者皆为肺腺癌IV期。按照肿瘤有无转移分为：无转移12例和脑转移8例。排除标准：1)合并高血压病、糖尿病、感染性疾病、风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病、长期使用激素、近期手术、创伤、严重心肝肾疾病病例；2)1个月内使用过抗凝或促凝药物病例。

1.2 二代测序

血液样本及DNA提取：使用Streck采血管采集10 ml外周血，轻柔颠倒10次6-35℃保存，备用。 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen) 用于血液DNA提取，Nanodrop 检测 DNA 的纯度(OD 260/280比值)。琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 降解程度以及是否有 RNA、蛋白质污染。Qubit 对 DNA 浓度进行精确定量。其中 OD 值在1.8-2.0之间，含量在20ng以上的 DNA 样品被用来构建文库。

文库构建及靶向捕获：将样本提取的 DNA随机打断成长度为180-220 bp的片段，经末端修复和加 A 尾后在片段两端分别连接上接头制备 DNA文库。采用自主研发的靶向捕获芯片，经过建库和文库捕获进行目标 DNA的高效富集，然后在Illumina NextSeq CN500平台上进行高通量、高深度测序。建库和捕获均严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照最新优化实验流程进行操作。

测序及生信分析：根据库检合格文库的有效浓度及数据产出需求进行 Illumina CN500 平台PE150测序。测序结束获得原始测序序列(Raw Data)后，进行质控分析；变异信息通过BWA工具与人类基因组(hg19)进行比对，通过GATK对测序片段进行连接优化，SNP/Indel通过VarScan2获得，分析的结果通过千人基因组和dbSNP数据库进行过滤，胚系突变通过白细胞分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 样本体细胞突变统计

体细胞突变是指除生殖细胞以外的体细胞所发生的序列变异，是发生在正常机体细胞中的变异，如发生在皮肤和器官。体细胞变异既不遗传自亲本，也不会传递给后代，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变。体细胞变异，特别是其中的驱动突变对解释肿瘤的发生和发展具有非常重要的意义。

本研究中采用的靶向捕获panel共包含12个肺癌中常见的突变基因(表1)。突变检测结果如图1所示，在20例病人样本中，共检测到4种体细胞突变，分别为EGFR突变(在9例病人中发现，突变率45%)、PI3KCA(2例，10%)、KRAS(1例，5%)、NRAS(1例，5%)，共计10人具有不同程度的基因突变，其余10人未检测到突变。

表1 基因检测列表

图1 突变频率图

2.2 基因突变频率

研究进一步将发生脑转移患者与未发生脑转移患者进行分组比较，在12例未发生脑转移的病人中，有5人被检测出有不同程度的基因突变，占比41.67%，其余7人未发现突变；在8例发生脑转移的病人中，5人(62.5%)被检测出有基因突变，其余3人未发现(表2)。

根据临床特征对高频突变进行分组分析，获得肺癌脑转移组和肺癌非脑转移组高频突变图，肺癌脑转移组相比非脑转移组具有更多的突变基因特征，脑转移组不仅有EGFR、PIK3CA突变，而且还有KRAS、NRAS突变，同时相比非脑转移组，脑转移组发生基因突变频率更高。过往报道，EGFR、PIK3CA、KRAS、NRAS均是肺癌驱动基因，因此，相比肺癌非脑转移组，脑转移机制更复杂，驱动基因更多。

表2 两组基因突变率

3 讨论

肺癌是一类严重威胁人类生命健康的恶性疾病，是目前全球范围内癌症相关死亡病因中致死率最高的疾病，2012年全球肺癌新增病例180万，约占全部癌症患者的13%[2]。肺癌根据其分化程度和形态特征可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占80%-85%，新诊断非小细胞肺癌患者中有10%-25%已发生脑转移，40%-50%患者治疗中发展为脑转移[3]，脑转移后患者中位总生存期(OS) 仅为3-6个月[4]，所以能否尽早检测到脑转移的发生并及时进行治疗，对患者的预后具有很大的影响。因此，本研究通过比较非小细胞肺癌脑转移患者与未脑转移患者的循环肿瘤DNA的突变情况，探究非小细胞肺癌脑转移患者的分子特征，为非小细胞肺癌脑转移监测及靶向用药研究提供理论依据。

研究中靶向捕获的基因均为肺癌常见突变基因，在20例样本中，有9例病人被发现有EGFR基因的突变，突变率为45%，这与以往报道的亚洲人群肺腺癌Ⅲ-Ⅳ期患者的EGFR突变率51.4%相近[5]，提示结果的可信度较高，但由于样本量的限制及样本的地域局限性，还存在一定偏差。除EGFR突变外，研究中还发现了PIK3CA、KRAS、NRAS三种突变，突变率分别为10%、5%、5%，虽然突变频率相对较低，但是已有过往的研究证实，这些基因均为肺癌发生的驱动基因，它们的突变对肺癌的发生往往产生了决定性的影响。

进一步比对发生脑转移与未发生脑转移患者的体细胞基因突变情况发现，脑转移组突变率为62.5%(5/8)，非脑转移组为41.67%(5/12)，相比非脑转移组，脑转移组的突变率升高。此外，脑转移组中不仅发现了同样存在于非脑转移组的EGFR与PIK3CA突变，还发现了未在非脑转移组中检出的KRAS及NRAS突变，提示肺癌的脑转移相比非脑转组具有更多的基因突变特征及更复杂的发生机制。

综上所述，肺癌脑转移患者往往更容易发生体细胞突变，且突变数目较非转移患者多，突变频率更大，利用基于二代测序的基因靶向捕获技术可以检测到二者分子层面的差异，描绘二者的基因突变特征，为脑转移的早期筛查甚至靶向用药提供了重要的指导意义。